抑制消减杂交的原理及应用

抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。

(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。

其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。

因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。

抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。

同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。

（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。

②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。

长链3′端与cDNA5′端相连。

长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。

此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。

抑制性消减杂交技术（ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等于１９９６年依据消减杂交和抑制ＰＣＲ发展起来的一种分离差异表达基因的新方法［１，２］，该技术具有假阳性率低、筛选效率高、操作简单等优点，特别适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。

而消减文库是使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如同类菌种的高产、低产品系），提取ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ，在一定条件下用大大过量的不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），与含有目的基因的试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）进行杂交，选择性的去除两部分共同基因杂交形成的复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，连接到载体形成文库。

高等真核生物的所有生命现象，例如细胞生长、器官形成、恶性转化、特定代谢产物分泌等都是基因选择性表达的结果，要弄清这些生命现象的分子调节机制，就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析，然后研究其氨基酸组成，表达产物的结构功能。

抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具。

１ＳＳＨ的基本原理与过程［３，４］１．１提取样本ｍＲＮＡ，利用随机引物反转录为双链ｃＤＮＡ，将不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），含有目的基因的样品称为试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）。

１．２用识别四碱基的限制性内切酶ＲｓａＩ（或ＨａｅⅢ）酶切。

双链ｃＤＮＡ经酶切后，每个片段一般小于６００ｂｐ，可防止长链ｃＤＮＡ片段所形成的复杂结构干扰消减杂交。

１．３将ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ分成两组（１和２），分别于其５′端接上去磷酸化的接头１和接头２（ａｄａｐｔｏｒ１，ａｄａｐｔｏｒ２）。

两接头分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，由一长链（约４０余个核苷酸）和一短链（约１０余个核苷酸）组成的双链ＤＮＡ片段，长链外侧２０余个核苷酸序列与第一次ＰＣＲ引物序列相同，而内侧序列与第二次ＰＣＲ引物序列相同。

・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆　景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘　要:　基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。

在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。

近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。

主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。

关键词:　抑制性消减杂交　差异表达　功能基因　DS N 均一化技术　c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t:　D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s:　Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。

抑制消减杂交及其在鱼类基因克隆中的应用摘要：抑制消减杂交在研究差异基因表达上表现出很大的优势，其运用在人类及高等脊椎动物中已很成熟，在对鱼类的研究中还有待进一步的发展。

关键词：鱼类；抑制消减杂交；生殖与发育基因；免疫调控相关基因1 引言随着人类基因组计划的完成及后基因组计划的启动，差异基因表达就成了一项热门的技术。

由于分子生物学及相关技术的迅猛发展，在转录水平研究差异基因表达的方法也层出不穷。

目前，研究较多的主要有mRNA差异显示技术(DDRT- PCR)、代表性差异分析技术(RDA)、基因表达系列分析技术(SAGE)、cDNA 微阵列技术(cDNA microarray)和抑制消减杂交技术(SSH)。

其中抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization SSH）是一种将抑制PCR与消减杂交技术相结合的一种快速分离差异表达基因的方法，它将传统的消减杂交方法与抑制PCR 相结合，比较2个细胞群的mRNA 以获得差异表达的基因克隆，具有检测的特殊性，在动物、植物、微生物的生殖和发育等相关领域中得到了广泛应用。

鱼类中，抑制消减杂交的应用仅限于生殖和发育相关基因和免疫调控相关基因的研究上。

2 SSH的原理和步骤示意图2.1 SSH的原理抑制消减杂交技术是由Diatchenko等[1]于1996年以mRNA差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。

它主要基于最近出现的抑制PCR ，并结合标准(normalization 或equalization ) 和消减杂交( subtractive hybridization)。

抑制PCR 通过利用含引物序列的双链接头(adaptor) 充当引物模板，使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列，PCR 中不能扩增，从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。

标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA的丰度，即低丰度差异表达的基因不会丢失，而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。

抑制差减杂交（SSH）抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。

同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头,因此杂交时将产生5种不同类型的分子a、b、c、d和e(图1),当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列因两端存在反向重复序列,退火时易产生类似”锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。

抑制差减杂交(SSH)技术的主要步骤有:(1)cDNA的合成与酶切;(2)试验组cDNA分成两份,并与两个不同的接头连接;(3)试验组(tester)的cDNA与过量的驱动组(driver)cDNA杂交;(4)选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子;(5)克隆PCR产物,构建差减文库;(6)筛选文库SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析,样品间的差异不宜太大或太小,而对于多个样品则无能为力,这在很大程度上限制了它的应用。

提取tester RNA的时期非常关键,选择使用该方法时,首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期,取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难,或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。

从技术本身讲,提取的tester RNA和driver RNA及从中分离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的成败。

另外SSH所需的起始RNA量较大,一般为几微克,对于一些珍贵稀有的不易获得足够RNA的材料要慎重使用。

SSH方法在研究植物基因的差异表达方面已得到有效应用,该方法在应用范围和深度上可进一步拓宽和加深:(1)利用SSH方法研究生物(如细菌和真菌等)和非生物逆境(如干旱和寒冷等)对植物的影响及生物与寄主植物的互作时,可进一步提早取材时期(如逆境诱导后的6小时或更早)和缩短取材间隔,以获得植物差异表达基因的表达动态和进行有关转录因子等方面的研究,进而获得植物与逆境互作的关键点,更好地理解其互作机制,为从分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供更可靠的理论依据。

抑制性消减杂交技术抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术。

通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的扩增。

该技术是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基础上建立起来的cDNA消减杂交方法，它克服了DD法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。

抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR 反应为基础，将标准化测试cDNA 单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。

通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA 片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。

所谓抑制性PCR 是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增。

抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下。

首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA 样品反转录为cDNA，把含有目的基因的cDNA 称为测试(tester)，把参考cDNA 称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I 切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA 分为两份，每份连接不同的接头，即接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2)。

接头为双链DNA 片段，且5’- 端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA 的5’- 末端连接，两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交。

第一次杂交每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。

抑制性消减杂交技术在对虾基因克隆中的应用
抑制性消减杂交技术在对虾基因克隆中的应用
抑制性消减杂交技术是一项筛选、分离未知差异表达基因的试验方法,该技术具有快速、简便、灵敏、特异、高效,所需起始样本量较少等优点.利用该技术构建对虾组织消减cDNA文库,鉴定差异表达相关基因及其表达特性.通过对对虾差异性表达的免疫相关基因、抗病基因及其他性状基因的了解,旨在为进一步研究对虾抗病机理奠定基础,为利用抗病基因进行抗病育种提供一个有效途径,为提高对虾的经济效益提供前景.
作者：赵永贞蒋伟明陈秀荔李咏梅张彦明黎铭陈晓汉 ZHAO Yong-zhen JIANG Wei-ming CHEN Xiu-li LI Yong-mei ZHANG Yan-ming LI Ming CHEN Xiao-han 作者单位：赵永贞,蒋伟明,陈秀荔,李咏梅,黎铭,陈晓汉,ZHAO Yong-zhen,JIANG Wei-ming,CHEN Xiu-li,LI Yong-mei,LI Ming,CHEN Xiao-han(广西水产研究所广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁,530021)
张彦明,ZHANG Yan-ming(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵,712100)
刊名：动物医学进展PKU英文刊名：PROGRESS IN VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2008 29(4) 分类号：Q78 S945.46 关键词：抑制性消减杂交对虾差异表达基因 cDNA文库。