实验八 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别
一、实验目的
1.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式；
2. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；
3.掌握酵母子囊孢子的观察方法。
二、实验原理
1. 酵母菌
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。
大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。本实验通过美蓝染液水浸片法来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。
2. 美蓝染液
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝溶液对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
三、实验材料
1. 菌种
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养1天的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。
2. 溶液或试剂
0.1%吕氏碱性美蓝溶液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、95%乙醇，等。
3．器材
显微镜，擦镜纸，吸水纸，载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、镊子等等。
四、实验步骤
1、酵母菌出出芽方式的观察及死活鉴定 （1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种蘸取取少量液体酵母放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。
注：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。
用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。
（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
注：盖玻片不宜平放，以免产生气泡。
（3）将制片立即放在显微镜下镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
（4）将制片放置约5min后镜检，注意死细胞数量是否增加。
（5）染色约30min后再次观察，注意死细胞数量是否增加。
2、酵母菌子囊孢子的观察
（1）涂片 在载玻片中央加一滴蒸馏水，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。
（2）干燥固定 用夹子夹住载玻片，在酒精灯上方来回移动，注意不要将载玻片距离火焰太近，以免烫死酵母菌。
（3）染色 用5%孔雀绿水溶液覆盖1.5～2min；水洗；95%乙醇脱色30s；水洗；0.5%番红水溶液覆盖1min；水洗；干燥。
（4）镜检 将制好的装片放在显微镜下镜检，由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。
五、实验报告
1、实验结果
（1）酵母菌的死活鉴别
时间 立即观察 5min后 30min后
死活情况 少数死亡 大部分死亡 几乎全部死亡
（2）形态
酵母菌一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬性。菌落形态与细菌相似，但较大较
厚，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
酵母（10×40） 资料
（3）囊孢子
啤酒酵母的有性繁殖产生子囊和子囊孢子。在进行有性繁殖时，两个单倍体的营养细胞结合，质配后发生核配，形成二倍体细胞。这种二倍体细胞在许多情况下能通过出芽繁殖延续几代。在适当的条件下，二倍体细胞的核可进行减数分裂，形成子囊孢子。
啤酒酵母的子囊孢子
资料 （10×100）
2、思考题
（1）根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液作用时间与酿酒酵母死、活细胞比 例变化是否有关系？试分析原因。
答：时间越长则视野中死亡酵母菌比例越大。原因：酵母菌处于吕氏碱性美蓝染
液中会导致细胞脱水死亡，时间越长，细胞死亡数量越多。
（2）酿酒酵母除通过出芽方式进行无性生殖外，还可以形成子囊孢子进行有性
生殖，你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？若未观察到，试分析原因（提
示：子囊孢子的形成与培养条件有关）。
答：没能成功观察到酿酒酵母的子囊孢子。酵母菌在条件恶劣的情况下形成子囊
和子囊孢子，进行有性繁殖，所以原因可能为培养酵母菌的环境不够恶劣，酵母菌没有进行有性繁殖或者仅有少数进行有性繁殖。最主要的原因是染色不够成功，实验中，用显微镜观察时视野中的酵母菌全部是绿色的，其他同学的染色结果多数全部是红色。。
注意事项：
1. 锥形瓶中装入的液体培养基应不超过30%，避免加液量过多导致菌液内部缺氧。
2. 培养时锥形瓶顶部不能用棉塞密封，应用纱布以保证更好的通透性。
3. 从培养1的液体培养基中取菌液前应先摇动锥形瓶，因为长时间培养后菌体会沉积到锥形瓶底部。
附录：麦氏（Meclary）琼脂（酵母菌）的配置（1000ml）
葡萄糖 1g
KCl 1.8g
酵母浸膏 2.5g
醋酸钠 8.2g
琼脂 15～20g
蒸馏水 1000ml
113℃灭菌30min。
