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dcfh-da活性氧检测原理DCFH-DA（Dichlorofluorescein Diacetate）是一种常用的细胞活性氧（ROS）检测试剂，常用于测量细胞内ROS的水平。
下面将详细介绍DCFH-DA活性氧检测原理。
活性氧（ROS）是包括超氧阴离子（O2^-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）等化学物质的总称，它们在细胞内被不同的酶系统产生，并在一定程度上参与调节细胞的生理功能。
然而，当细胞内ROS的产生量超过细胞应对能力时，ROS会产生一系列不利于细胞健康的效应，如氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等，从而引发多种疾病的发生。
DCFH-DA是一种脂溶性染料，可以通过细胞膜进入细胞内。
一旦进入细胞内，细胞内酯酶会水解DCFH-DA成为非荧光染料DCFH （Dichlorofluorescein）。
DCFH在细胞内没有荧光，但当与ROS接触时，ROS会氧化DCFH成为强荧光荧光素（DCF）。
DCF既可以通过细胞色素c还原成DCFH，也可以通过氧化还原酶系统产生交替的氧化还原反应。
这使得DCF在细胞内荧光物质充分利用细胞内不同环境中ROS含量变化敏感性。
DCFH-DA活性氧检测的原理主要包括两个方面：首先，DCFH-DA通过脂溶性能够迅速进入活细胞，然后在细胞中被酯酶水解为DFCH，DFCH可以被氧化成强荧光的DCF。
然后，DCF可以发射可见光区的绿色荧光，并且荧光的强度和ROS的浓度呈正相关关系。
因此，通过测量DFC发出的荧光信号的强度，可以间接反映细胞内ROS的水平。
在实际的检测过程中，研究人员通常将DFCH加入到细胞培养基中，培养一段时间以使DFCH进入细胞内。
然后，用PBS（磷酸盐缓冲液）彻底地洗涤细胞，以去除细胞外的DFCH。
然后，通过显微镜或流式细胞术等方法观察细胞内的强荧光信号，并定量测量荧光强度。
通过与一系列的标准曲线比较，可以将荧光信号转换为ROS浓度。
综上所述，DCFH-DA活性氧检测利用DFCH的荧光属性实现了细胞内ROS水平的可视化和定量测量。
线粒体膜电位指示染料线粒体膜电位的下降是细胞凋亡初期的一个标志性事件. 它在凋亡进程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。
基于以上研究，Biotium 研发了各类的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。
MitoView ™ 633MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。
利用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒能够在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。
图 1. 利用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组利用staurosporine 作为凋亡诱导剂。
利用MitoView ™633 染色图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处置(B)的Jurkat 细胞（JC-1 染色）. FL1 (x- 轴) 为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。
(A 图) 较高的红绿荧光比例说明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明：由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的转变。
在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，能够产生红色的荧光(激发光/发射光585/590nm)。
相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，如此能够利用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的转变。
经常使用红绿荧光的相对照例来衡量线粒体去极化的比例。
细胞测定SOD活力的原理细胞测定超氧化物歧化酶（SOD）活力的原理主要基于SOD对超氧自由基（O2-）的清除能力。
SOD是生物体内一种重要的抗氧化酶，能催化超氧自由基的转化为较低活性的分子氧（O2）和过氧化氢（H2O2），从而保护生物体免受超氧自由基的损伤。
在测定SOD活力的实验中，一般采用化学法或生物法两种方法。
化学法通常是使用人工合成的化学发光剂(xanthine/xanthine oxidase)和超氯酸钾（KCN）来模拟体内超氧自由基的产生，并通过测定化学发光剂的降解程度来评估SOD清除超氧自由基的能力。
具体步骤如下：1. 准备实验体系：将待测细胞或组织样品加入含有xanthine和xanthine oxidase的试剂体系中，同时加入超氯酸钾。
2. 反应过程：xanthine被氧化产生脲和超氧自由基，超氧自由基进一步被xanthine oxidase催化生成较稳定的过氧化氢。
过氧化氢可与KCN反应产生光反应活性物质，生成可测定的化学发光底物。
3. 测定化学发光：使用光度计测定体系中化学发光底物的发光强度，发光强度与SOD活力呈负相关关系，因此测定的发光强度越低，代表SOD活力越高。
生物法则是通过SOD对细胞的保护作用来测定其活力，这种方法更适用于体内和体外的生物样本。
具体步骤如下：1. 细胞培养：将待测细胞培养在含有氧气和营养物质的培养基中，使其生长到一定程度。
2. 细胞处理：将细胞分成对照组和实验组，对照组只添加培养基，实验组添加不同浓度的SOD。
然后将细胞组织进行处理，如添加诱导剂或细胞损伤剂。
3. 细胞存活率测定：使用细胞存活率检测试剂（如MTT、CCK-8等）测定细胞的存活率。
细胞存活率与SOD活力呈正相关关系，因此细胞存活率越高，代表SOD活力越强。
4. 数据分析：通过对实验组和对照组细胞存活率的比较，可以得出细胞中SOD 活力的相对变化情况。
总结起来，细胞测定SOD活力的原理主要是通过化学发光法或生物法来测定细胞对超氧自由基的清除能力。
生物活性测定法的原理
生物活性测定法是一种通过观察或测量生物体对化学物质或其他环境因素的反应来评估其活性的方法。
常用的生物活性测定法包括细胞增殖或生长抑制实验、细胞毒性实验、酶活性实验、抗菌活性实验等。
生物活性测定法的原理主要基于以下几个方面：
1. 细胞反应原理：生物活性测定法常通过观察或测量细胞对化学物质的反应来评估其活性。
例如，通过在培养基中加入待测物质，观察细胞的增殖情况或生物学特征的改变，从而评估其对细胞的生长抑制或促进作用。
2. 酶反应原理：酶在生物体内发挥着极为重要的生物催化作用。
生物活性测定法中常通过测量酶的活性来评估待测物质的生物活性。
例如，通过添加待测物质到含有酶底物的体系中，观察酶反应的速率或生成产物的量来评估待测物质对酶的影响。
3. 细菌抗菌原理：生物活性测定法中常通过测量待测物质对细菌的抑制作用来评估其抗菌活性。
例如，利用平板扩散法或微量稀释法，将待测物质与细菌共同培养，观察细菌的生长情况或测量细菌的最小抑菌浓度，从而评估其抗菌活性。
4. 动物体内反应原理：一些药物或化学物质的生物活性往往需要通过动物体内实验来评估。
常见的方法包括动物行为观察、组织活检、毒性评估等。
通过观察
动物对待测物质的生理、行为或组织结构的变化，来评估其生物活性。
综上所述，生物活性测定法的原理主要是通过观察或测量生物体对待测物质的反应来评估其活性。
具体的原理可以根据不同实验方法和待测物质的性质来确定。
案例分析新课程NEW CURRICULUMD1=D C-λ，A1=A C-1，B1=A1+B C-1，构成一个等比数列｛a n+D1λn+A1n+ B1｝，问题得解。
6.形如a n+1=Ca n+D·λn+An+B（A，B，C，D，λ为常数且C≠0，1，λ≠0，1，C≠λ）的数列通项公式的求法对a n+1=Ca n+D·C n+An+B，综合3、4两种类型设a n+1-D（n+1）C n+［A1（n+1）+B1］=C（a n-DnC n-1+A1n+B1）求得常数A1=A C-1，B1=A1+B C-1，构成一个等比数列｛a n+DnC n-1+ A1n+B1｝，问题得解。
说明：上述求法的本质是均由递推公式变形，通过换元，构造出一个新的等差或等比数列，从而转化为基本数列———等差、等比数列的问题来解决。
•编辑董慧红自由基和其他活性O、N、Cl粒子，被广泛认为对于许多与年龄有关的病的发展有作用。
或者，它甚至可以通过氧化和氧化损害对老化过程本身起作用。
许多研究已经显示，对于老年痴呆症病人脑中所有主要种类生物分子的不断增加的氧化损害，其他氧化损害牵涉到的疾病，包括癌症、动脉硬化症以及其他神经退化疾病和糖尿病。
在这篇报道中，我们将调查测定活性物种的可行性方法，并特别强调对人类研究的应用。
许多诱人的技术，例如，L-谱带具有硝酰探针的电子自旋共振成像自旋陷阻，在所有动物中直接测定活性物种还有待发展。
但是目前为止，还没有探针适合人类使用。
大部分活性物种在体内仅仅持续很短的时间，并且无法直接测定。
有几个例外：包括H2O2（下面将讨论），或者还有NO。
在某种意义上NO2-浆液水平已经被要求脉管合成。
基本上有两种方法来检测短暂的活性物种：●尝试去阻止这些物种并测定这些被阻物种的水平。
●测定由活性物种引起的损害的水平，那就是说，氧化损害的量。
有些时候，也会用其他的方法。
他们包括测定红血球抗氧化损害和所有抗氧化物在体内的流动活性，这些参数的降低常常作为氧化胁迫的证明。
细胞功能检测细胞功能检测是指对生物样品中的细胞进行测试和分析，以评估其功能状态和活性水平。
这种检测可以用于研究细胞生理学、疾病诊断和治疗等领域。
下面介绍几种常见的细胞功能检测方法。
1. 细胞生存和增殖检测：这种检测方法可以评估细胞的生存能力和增殖速度。
常见的方法包括细胞计数、细胞活力和增殖指标的测定。
细胞计数可以用显微镜观察和细胞计数仪进行，细胞活力可以通过测定细胞色素c释放量、ATP产量等指标来评估，增殖指标包括细胞周期、有丝分裂指数等的测定。
2. 细胞凋亡检测：细胞凋亡是正常的细胞死亡过程，对维持组织结构和功能起着重要作用。
细胞凋亡的检测可以使用多种方法，如细胞凋亡标记物的染色、DNA片段化检测和细胞凋亡相关蛋白的测定等。
常用的染色方法有TUNEL法、AnnexinV染色法等，可以直接或间接地检测细胞凋亡的存在和程度。
3. 细胞分化检测：细胞分化是未分化细胞向特定细胞类型发育和成熟的过程。
细胞分化的检测可以通过测定特定分化标记物的表达来评估。
例如，神经细胞的分化可以通过检测神经元特异性标记物如神经元特异性聚糖、神经元特异性酶等的表达来判断。
4. 细胞迁移和侵袭检测：细胞迁移和侵袭是细胞在体内的基本生理过程，在肿瘤的发生和转移中具有重要的作用。
细胞迁移和侵袭能力的检测可以使用Transwell迁移实验、划痕愈合实验等方法，通过观察细胞通过细胞孔隙和划痕进入下一层细胞的能力来评估。
5. 细胞代谢功能检测：细胞代谢是维持细胞生命活动所必需的重要过程之一，包括能量代谢、蛋白质合成和降解、核酸代谢等。
细胞代谢功能的检测可以通过测定细胞中某些代谢产物的含量、酶活性的测定、氧化还原能力的测定等来评估。
细胞功能检测是实验生物学研究和临床医学诊断的重要手段之一。
通过细胞功能检测，人们可以了解细胞在不同条件下的功能状态和活性水平，从而更好地研究细胞生理学机制、发现新的疾病标记物和药物靶点，为疾病的诊断和治疗提供新的线索和方法。
Peptides, Inhibitors, AgonistsProduct Data Sheet产品名: Cell Counting Kit-8 (CCK-8)产品编号: GK10001功能属性应用: 1) 细胞增殖测定-GlpBio细胞计数试剂盒-8（CCK-8）是水溶性的，在培养中是稳定的，并且是无毒的。
2) 细胞活力测定-代谢活性和染料产生与改变的活力成比例地变化。
3) 细胞因子测定-测量细胞因子诱导的增殖。
如果需要，可以在研究结束时回收细胞并扩增。
4) 细胞毒性测定-来自细胞毒性化学物质的细胞死亡对颜色发展没有影响，只有活细胞将试剂转化为比色指示剂。
试剂本身具有可忽略的毒性，并且通常对细胞是安全的。
运输方式: 蓝冰运输。
储存条件: 储存在4°C避光，可稳定长达12个月。
储存在-20°C避光，可稳定长达2年。
实验参考方法细胞数量确定1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96洞孔板中。
将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。
2.向板的每个孔中加入10μLCCK-8溶液。
注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。
细胞增殖和细胞毒性测定1.将种子细胞以104-105个细胞/孔的密度在96孔板中在100μL培养基中培养，含有或不含有待测化合物。
将细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。
2.将10μL不同浓度的待测物质加入板中。
3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24或48小时）。
4.使用重复移液器向板的每个孔中加入10μLCCK-8溶液。
注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
6.在读取印版之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。
7.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。
MTT MTS CCK-8活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT复原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并堆积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（ DMSO ）能溶解细胞原理中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波优点测定其光汲取值，可间接反应活细胞数目。
在必定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。
MTS 是一种新合成的四唑类化合物，与 MTT 原理同样， MTS也是经过被活细胞内线粒体内的多种脱氢酶复原成橙黄色的Formazan 进而反应细胞活力状况。
CCK-8 在电子载体 1- 甲氧基-5- 甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（ 1-Methoxy PMS ）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶复原为拥有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。
生成的甲臜物的数目与活细胞的数目成正比。
用酶联免疫检测仪在450nm波优点测定其光汲取值，可间接反应活细胞数目。
1、简单、快捷，正确测定细胞的增值反响，能防止因为人为操作要素造成的试验偏差，大大地提升了试验结果的正确性优点1、操作简单，比 MT T高效，产生水溶性的 Formazan，无需用DMSO 溶解；2、因为 MTS 被复原后生成的甲瓒产物颜色较深，吸光度值变异范围大，使测定更为敏感正确，阴 / 阳性的判断也比较简单；3、迅速，作用时间 2-3小时为最正确，而 MTT 需 4小时；4、重复性好，复原产物稳固1、使用方便，省去了清洗细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测迅速；3、敏捷度高，甚至能够测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT ；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用；7、水溶性，不需换液，尤其合用于悬浮细胞1、因为 MTT 经复原所产生的1、试剂比较贵甲臜不溶于水，需被溶解后才能检测，对实验结果的正确性弊端产生影响；2、不太合适悬浮细胞活性检测1、与 MTT 对比， CCK-8 和XTT 的价钱比较贵；2、 CCK-8 试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培育基颜色靠近，不注意的话简单产生漏加或多加XTTXTT 作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞复原成水溶性的橙黄色甲臢产物。
生物活性测试的原理与方法生物活性测试是用来评估物质对生物体的活性的一种实验方法，可以用来研究物质对疾病的治疗作用、毒性作用以及其他生物效应。
其原理和方法主要包括以下几个方面：一、生物活性测试的原理：生物活性测试的基本原理是利用生物体作为测试对象，通过观察生物体的生理反应、药物代谢以及疾病模型的建立，来评估物质对生物体的活性。
生物活性的产生通常是由于物质与生物体的生物分子发生相互作用，进而影响生物体的生理功能。
二、生物活性测试的方法：（一）细胞活性测试：细胞活性测试是一种常用的生物活性测试方法，通过将物质加入到细胞培养基中，观察对细胞的生长、分裂、凋亡等生物学行为的影响。
常用的细胞活性测试包括MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法、CCK-8（Cell Counting Kit-8）法等。
（二）动物活性测试：动物活性测试是一种比较复杂的生物活性测试方法，通过给动物投放物质，观察其对动物的生理反应、生化指标的改变以及对疾病模型的影响，来评估物质的生物活性。
常用的动物活性测试包括急性毒性测试、慢性毒性测试、药效学实验等。
（三）靶标活性测试：靶标活性测试是通过与生物体内相关的蛋白质靶标相互作用，来评估物质对蛋白质功能的影响。
常用的靶标活性测试包括酶活性测定、蛋白质结合实验、分子动力学模拟等。
（四）体外体内活性测试：体外体内活性测试是将物质在体外和体内进行测试，综合评估物质对生物体的活性。
体外活性测试一般包括细胞外药效学实验、体外脏器模型实验等。
体内活性测试则通过给动物或人类实验对象投放药物，观察其对整体生物的生理反应、药代动力学等。
（五）相关指标的测定：在生物活性测试中，还可以通过测定相关的生物标志物来评估物质的生物活性。
如测定病理标记物、生物化学指标以及生物体的组织学改变等。
总结：生物活性测试的原理和方法主要包括细胞活性测试、动物活性测试、靶标活性测试、体外体内活性测试以及相关指标的测定等。
一、实验目的1. 了解细胞酶活性的概念和测定方法；2. 掌握影响细胞酶活性的因素；3. 通过实验，验证不同因素对细胞酶活性的影响。
二、实验原理细胞酶活性是指酶在特定条件下催化化学反应的能力。
酶活性的高低受多种因素影响，如温度、pH值、底物浓度、酶浓度、激活剂、抑制剂等。
本实验通过测定细胞酶活性，探讨不同因素对酶活性的影响。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、葡萄糖、磷酸盐缓冲液、pH计、温度计、酶活性测定试剂盒等；2. 实验仪器：恒温培养箱、离心机、酶标仪、移液器、试管等。
四、实验方法1. 制备细胞悬液：将大肠杆菌细胞在适宜温度下培养，收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤，制成细胞悬液；2. 酶活性测定：取一定量的细胞悬液，按照酶活性测定试剂盒说明书进行操作，测定酶活性；3. 影响因素实验：（1）温度对酶活性的影响：将细胞悬液分别在低温（0℃）、常温（25℃）、高温（45℃）条件下进行酶活性测定；（2）pH值对酶活性的影响：将细胞悬液分别在pH值为3、5、7、9、11的磷酸盐缓冲液中进行酶活性测定；（3）底物浓度对酶活性的影响：将细胞悬液在底物浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的葡萄糖溶液中进行酶活性测定；（4）酶浓度对酶活性的影响：将细胞悬液在酶浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 U/mL的条件下进行酶活性测定；（5）激活剂和抑制剂对酶活性的影响：在细胞悬液中加入适量的激活剂和抑制剂，进行酶活性测定。
五、实验结果与分析1. 温度对酶活性的影响：实验结果显示，酶活性在常温下最高，低温和高温条件下酶活性均有所下降。
这表明酶活性对温度较为敏感，在一定温度范围内，酶活性随温度升高而增加，超过最适温度后，酶活性下降。
2. pH值对酶活性的影响：实验结果显示，酶活性在pH值为7时最高，pH值偏离最适pH值后，酶活性下降。
这表明酶活性对pH值较为敏感，在最适pH值下酶活性最高。
细胞定量报告分析引言细胞定量报告分析是一种常见的实验室技术，用于研究细胞数量、细胞增殖以及细胞活性等方面的信息。
它可以帮助科研人员了解细胞在不同条件下的变化情况，从而推断细胞的生理过程和疾病发展机制。
本文将介绍细胞定量报告分析的基本原理、常用的实验方法以及数据处理和结果分析。
基本原理细胞定量报告分析的基本原理是利用某种特定的生物标记物，如荧光染料或酶标记物，与细胞发生特异性的反应，从而测定细胞数量或活性。
不同的标记物可用于不同的细胞分析，例如荧光染料可以用于细胞数量测定，酶标记物可以用于细胞活性测定。
实验方法1.细胞培养：首先，需要选择适当的细胞系进行培养。
常用的细胞系有人类细胞、小鼠细胞等。
细胞应根据实验需求，在合适的培养基中进行培养，并提供适当的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
2.标记物处理：将细胞处理成单细胞悬浮液，然后添加特定的标记物。
标记物可以选择与细胞表面的特定分子结合，或者通过细胞内某种特定酶的活性来反应。
标记物的选择应根据实验目的和细胞类型来确定。
3.测定细胞数量或活性：根据标记物的特性，选择合适的测定方法。
常用的方法包括流式细胞术、酶标仪测定、显微镜观察等。
在测定过程中，需要根据实验设计和标记物的特性选择合适的控制组和实验组进行比较。
数据处理与结果分析1.数据处理：将实验得到的原始数据进行整理和统计。
常见的数据处理方法包括计算细胞的平均数量或活性、计算标准差和标准误等。
2.结果分析：根据实验设计和研究问题的要求，对数据进行进一步的分析和解释。
可以使用统计学方法，如t检验、方差分析等，来比较不同组间的差异性。
同时，还可以进行相关性分析、线性回归等方法来探索细胞数量或活性与其他变量之间的关系。
结论细胞定量报告分析是一种重要的实验技术，可以帮助科研人员了解细胞的数量和活性变化，从而推断细胞的生理过程和疾病机制。
通过合理的实验设计、准确的数据处理和结果分析，可以获得可靠的实验结果和科学结论，为细胞生物学和医学研究提供有力支持。
细胞活性检测方法优化【摘要】目的在不吸出培养基的前提下，探讨MTT比色实验最佳溶解条件，以提高检测灵敏度和稳定性，降低本底，为悬浮细胞活性检测打下基础。
方法在96孔板接种不同密度肿瘤细胞，用MTT比色实验来测定。
比较不同溶解液溶解Formazan能力，并与传统溶解液进行比较。
结果当用10% SDS(pH4~5)作为溶解液所得OD值与细胞数目很高的相关性，43 h后测定与12 h后测定所得OD值差异无显著性。
结论在MTT实验中，可以用10% SDS(pH4~5)作为溶解Formazan的溶解液，与传统溶解液相比可提高检测灵敏度、稳定性和降低本底。
【Abstract】Objective To discussing the best dissolved conditions of the MTT colorimetric assay without discarding medium in order to enhance sensitivity,stability and lower background.Methods Inoculating the different density tumor cell in 96-well plates,detecting the tumor cell using MTT colorimetric assay.And dissolve the Formazan using different solutions.Contrast the dissolve capability of the different solutions.Results The OD value has high stability and correlation when Formazan was dissolved using 10% SDS(pH4-5).Conclusion In the MTT colorimetric assay,Formazan can be dissolved using 10% SDS(pH4-5).And the new solutions can enhance sensitivity,stability and lower background.【Key words】MTT colorimetric assay;SDS;Cell activity细胞活性检测方法很多，如细胞计数法、结晶紫法、单细胞克隆法、3H-TdR 法和MMT法等[1]。
注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TB337。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，免费电话: 8008108133，E-mail: promega@promega.com.cn 技术手册号码：CTB337
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BacTiter-GloTM 微生物细胞活性检测 本说明书用于产品G8230, G8231, G8232和G8233。 所有的技术文献均可从公司网站www.promega.com得到 请访问公司网站以核准您所使用的技术手册为最新版本
I. 描述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1
II. 产品组成 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4
III. 进行BacTiter-GloTM 检测的操作指南………………………………….5
A.试剂制备…………………………………………………………………………...5
B.检测细菌中ATP的操作方法…………………………………………………… 5
C.制作ATP标准曲线（选做）的操作方法…………………………………………5
.Ⅳ 附录…………………………………………………………………………………..6
A. BacTiter-GloTM 检测概述………………………………………………………...6
B. 更多的考虑……………………………………………………………………….6
C. BacTiter-GloTM 检测应用举例…………………………………………………..8
熟练使用者的操作指南……………………………………………………….
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I. 描述 BacTiter-GloTM 微生物细胞活性检测系统用均质的方法，依据对所存在的ATP的定
量结果，确定培养物中活细胞的数目。ATP是具有代谢活性的细胞的指示物。BacTiter-GloTM 的设计既可以用于单管检测，也可用于多孔板形式的高通量筛选
目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。
一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。
另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。
显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。
如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。
所以最直接的证据应该采用方法一。
用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。
若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。
但更为常用的方法是BrdU检测法。
用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。
细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。
Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。
比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。
而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。
1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。
BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。
有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。
细胞活性测定方法细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。
核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。
而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。
因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。
另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。
代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。
使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。
通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。
FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。
前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。
后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。
正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。
不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。
用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。
缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。
常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。
为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
1．MTT法MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT法显色的条件（1）pH 值对MTT 实验结果的影响:MTT 实验体系的pH 值是影响实验结果的另一重要因素。
在偏碱性的环境中本底偏高,稳定性较差。
随放置时间延长而升高;偏酸性试液的实验结果比较稳定。
（2）酚红和血清对MTT 实验方法的影响:酚红是一种pH 中性指示剂,血清是细胞生长必需的营养成份,两者都是细胞培养液的基本成份。
酚红在pH7.0, 以上试液中呈紫红色,在570 nm 有较大光吸收值。
血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀,影响透光度。
（3）异丙醇等用作Formazan 溶剂,无须酸化也能消除酚红的影响: 为了消除酚红对MTT 实验结果的影响,Mosmann (1983) 提出用酸化异丙醇作Formazan 溶剂,酸化异丙醇可将酚红显示的紫红色转变为无色。
Francois (1986) 认为酸化异丙醇溶解Formazan 改变了原光谱特性,降低灵敏度,提出改用无酚红的培养基。
未经酸化的异丙醇在一定条件下也可以消除酚红的影响。
异丙醇等有机溶剂本身为弱酸性,能够中和中性和弱碱性试剂,如RPMI21640 (pH7.3) 。
当异丙醇与RPMI - 1640 的溶量比达到1∶1 以上时即可将酚红的紫红色转变成无色。
（4）细胞代谢酶存在部位对MTT 实验结果的影响:细胞线粒体产生的琥珀酸脱氢酶是细胞生长代谢产物,这种酶裂解MTT形成Formazan 是MTT实验方法的理论基础。
琥珀酸脱氢酶的产生和分布规律与MTT检验方法的灵敏度和稳定性有很大关系（5）MTT使用浓度选择:在不饱和状态下,或是细胞密度一定,MTT 不饱和;或是MTT一定,细胞密度不饱和,Formazan 的生成量分别与MTT浓度和细胞分泌的酶活性量呈线性关系。
达到饱和状态以后,两者为非线性关系。
为了提高MTT 实验方法的灵敏度,在细胞密度一定的条件下,应该使用MTT饱和浓度。
MTT的饱和浓度与细胞种类、细胞活力状态有关因此MTT 最佳使用浓度要视情况而定。
（6）MTT的酶裂解反应时间选择:MTT 在细胞培养体系中被细胞内线粒体产生的琥珀酸脱氢酶裂解生成Formazan ,完成这一反应需要一定时间。
MTT 裂解反应2.5h 反应已基本完成,3 h 反应相当完全,通常MTT实验应选择3 小时的反应时间。
（7）MTT的理化性质对其条件影响很大MTT是一种黄色粉状物,溶于水性溶剂,也溶于有机溶剂,但在有机溶剂中的溶解力低于水性溶剂,常温下需要较长时间才能溶解。
MTT 水溶液在pH 7.0 以下稳定,3～5周内不变性,在pH7.0 以上溶液中不太稳定,在异丙醇溶液中1 周内变色,2～3 周内变成兰紫色。
MTT 溶液呈黄色,在410 nm 波长处有最大吸收峰,随波长增大吸收值很快下降,至500 nm处趋于最低值。
MTT由酶裂解生成Formazan。
Formazan 不溶于水性溶剂,易溶于有机溶剂。
乙醇,丙醇,异丙醇,乙二醇甲醚,DMSO 等都是比较好的溶剂,Formazan 的有机溶液呈兰紫色。
细胞增殖实验通常在聚苯乙烯培养板上进行, 四氯化碳、10 %SDS 和二氧六环对培养板有溶蚀性,不宜使用。
DMSO 和SDS 对Formazan 也有较好的溶解性,但凝固点太高,10 ℃以下不能用; 丁醇等长碳链醇溶解Formazan 后与水相不混溶,呈分层液,不适合作Formazan溶剂。
2．XTT法XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物。
当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臜产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。
缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。
3．CCK-8法或称WST-8法CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。
生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。
用酶联免疫检测仪在450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
缺点：1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。
2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
由于是贴壁培养的细胞，在读吸光值时细胞培养板底部附着的细胞可能会对数值有一定的影响，因此建议在加入CCK-8 3－4小时后，将上清液重新吸取到另一干净的酶标板中进行读值，保证检测的准确性。
要防止反复使用同一瓶试剂后可能造成的试剂污染。
4. LDH释放法酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。
本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒（promega）。
应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。
5. 51铬（Cr）释放法本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。
6. 荧光测定法：如：alamarBlue一步荧光测定法alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。
具体测定方法是：在靶细胞孔（T）、效应细胞孔（E）和实验孔（T+E）各加alamarBlue,共育6~24h后用板式荧光测定仪测530nm（发射）/590nm（散射）波长荧光强度，将T及E孔荧光均值相加后减去实验孔（T+E）荧光均值，与T孔荧光均值比较即可计算CTL对靶细胞的溶解%。
本法与51Cr释放法纺织厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组间差异很小。
②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。
③alamarBlue的使用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。
④还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。
⑤多种粘附或非粘附细胞系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔即可）。
⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果。
7. SRB也叫磺基罗丹明B，是在酸性条件下可特异性地与细胞内蛋白结合的染料，SRB染色后不象MTT那样很容易变色，染色后干燥的板子可以放置较长时间，而后再用Tris碱液溶解SRB，比色测定，对结果没有影响。
