活力测定细胞复苏

细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。

细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。

1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。

6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。

通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。

这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

通过本实验，了解细胞活力测试的基本原理和方法，掌握MTT法（MTT比色法）测定细胞活力的操作步骤，并分析细胞在不同条件下的活力变化。

实验时间：2023年4月10日实验地点：细胞生物学实验室实验材料：1. 细胞系：人肺上皮细胞（A549）2. MTT试剂：3-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）3. DMSO（二甲基亚砜）4. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素5. 细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、吸管、试管、离心机、酶标仪等实验方法：1. 细胞培养：将人肺上皮细胞（A549）接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至新的培养瓶中。

3. 实验分组：将传代后的细胞分为实验组和对照组，实验组细胞在特定条件下培养，对照组细胞在正常培养条件下培养。

4. 细胞接种：将实验组和对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为5×104个。

5. 细胞培养：将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。

6. MTT实验：向每孔细胞中加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。

7. 终止培养：弃去孔内液体，向每孔加入150μl DMSO，振荡混匀。

8. 比色：用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度（OD）值。

9. 数据分析：计算实验组和对照组的细胞活力，并比较两组间的差异。

1. 实验组细胞活力较对照组显著降低，说明特定条件下细胞活力受到抑制。

2. 不同浓度药物处理的实验组细胞活力呈剂量依赖性下降，说明药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。

实验结论：通过MTT法测定细胞活力，可以有效地评估细胞在不同条件下的生长状态。

本实验结果表明，特定条件下细胞活力受到抑制，且药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。

实验讨论：1. MTT法是一种简单、快速、灵敏的细胞活力测定方法，适用于多种细胞系和药物筛选实验。

1.细胞活性测定方法介绍和使用探讨细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。

其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。

但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。

为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1、MTT法MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

2、XTT法XTT：化学名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞2.细胞复苏方法1．从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。

2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。

细胞工程实验报告实验课程：细胞工程实验内容：细胞复苏及存活率测定一实验目的1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。

2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。

3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。

二实验原理在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。

但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。

因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。

血球计数板：血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。

H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。

计数室：每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）三、主要仪器试剂设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、离心管等。

试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。

四实验步骤（复苏）●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。

●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。

（细胞死活鉴定及计数）➢用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。

把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。

➢取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。

➢如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。

细胞活力检测方法细胞活力是指细胞内外环境稳定，细胞结构完整，代谢活跃，功能正常的状态。

细胞活力的高低直接影响着生物体的生长、发育、免疫功能等多个方面。

因此，准确、快速地检测细胞活力对于生物学研究和临床诊断具有重要意义。

下面将介绍几种常见的细胞活力检测方法。

一、MTT法。

MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。

其原理是将MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物）加入培养基中，MTT会被细胞内的还原酶还原为可溶性的紫色产物，然后用溶剂将产物溶解，最后用酶标仪测定其吸光值。

吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。

二、CCK-8法。

CCK-8法是一种新型的细胞活力检测方法，其原理是将CCK-8（Cell Counting Kit-8）溶液加入培养基中，CCK-8会被细胞内的还原酶还原为橙黄色的产物。

然后用酶标仪测定其吸光值，吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。

相比MTT法，CCK-8法更为灵敏和稳定。

三、荧光染料法。

荧光染料法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理是利用荧光染料（如FDA、PI等）染色活细胞和死细胞，然后观察染色情况来判断细胞的活力。

活细胞呈绿色荧光，而死细胞呈红色荧光。

通过计数活细胞和死细胞的比例，可以间接反映细胞的活力情况。

四、细胞代谢物测定法。

细胞代谢物测定法是一种直接反映细胞活力的方法。

通过测定细胞产生的代谢产物（如乳酸、ATP等）的含量，可以客观地评价细胞的活力情况。

这种方法不仅可以用于细胞培养液的检测，也可以用于组织样本的检测。

综上所述，细胞活力的检测方法有多种多样，每种方法都有其独特的优势和适用范围。

在实际应用中，我们可以根据具体情况选择合适的方法来检测细胞活力，以便更好地开展生物学研究和临床诊断工作。

希望本文介绍的内容对您有所帮助。

实验名称：细胞冷冻复苏实验实验日期：2023年11月10日实验人员：张三、李四、王五一、实验目的1. 熟悉细胞冷冻和复苏的操作步骤。

2. 掌握细胞冻存过程中的保护剂选择和浓度控制。

3. 了解不同冷冻复苏方法对细胞活力的影响。

二、实验原理细胞冷冻复苏技术是将细胞置于超低温环境中，使细胞代谢活动减缓或停止，从而实现长期保存的技术。

复苏过程是将冻存的细胞恢复到正常生理状态，使其重新生长和分裂。

三、实验材料1. 细胞：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）2. 培养基：DMEM培养基3. 保护剂：二甲基亚砜（DMSO）4. 冻存管：无菌冻存管5. 液氮：液氮罐6. 移液器：移液器、枪头7. 培养箱：细胞培养箱8. 显微镜：倒置显微镜9. 台盼蓝染色液四、实验方法1. 细胞培养：将MEF细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养至对数生长期。

2. 细胞冻存：（1）将细胞用DMEM培养基洗涤2次，收集细胞。

（2）用移液器将细胞重悬于含有10% DMSO的DMEM培养基中，使细胞浓度为1×10^6个/mL。

（3）将细胞悬液转移至无菌冻存管中，每管1.5 mL。

（4）将冻存管置于-80℃冰箱中过夜。

（5）将冻存管转移至液氮罐中，长期保存。

3. 细胞复苏：（1）将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴中快速融化。

（2）将细胞悬液转移至培养皿中，加入适量DMEM培养基，置于培养箱中培养。

4. 细胞计数：用血球计数板对复苏后的细胞进行计数。

5. 细胞活力检测：用台盼蓝染色法检测细胞活力。

五、实验结果1. 细胞冻存：冻存后细胞形态正常，无死亡。

2. 细胞复苏：复苏后细胞形态正常，生长良好。

3. 细胞计数：复苏后细胞数量为1.2×10^6个。

4. 细胞活力检测：台盼蓝染色结果显示，复苏后细胞活力为95%。

六、实验讨论1. 细胞冻存过程中，选择合适的保护剂和浓度对细胞活力至关重要。

本实验中，使用10% DMSO作为保护剂，可有效保护细胞免受冷冻损伤。

细胞复苏流程细胞复苏是指将处于休眠状态的细胞重新恢复活力，使其恢复正常生理功能的过程。

细胞休眠可能是由于低温、缺氧、营养不足、药物作用等原因导致的。

细胞复苏的过程包括一系列复杂的生物化学反应和细胞内的分子修复机制。

首先，在细胞复苏的过程中，环境条件起着重要的作用。

对于低温导致的细胞休眠，温度的升高是细胞复苏的首要条件。

在逐渐升高的温度下，细胞开始逐渐恢复活力，并逐渐恢复正常的细胞膜功能。

此外，提供营养物质和氧气也是细胞复苏不可或缺的条件。

通过提供必要的营养和氧气，细胞可以开始分解和代谢有害物质，并逐渐恢复正常的细胞代谢功能。

其次，细胞复苏的过程中还涉及到一系列细胞内分子修复机制。

在细胞受损的过程中，细胞内的DNA和蛋白质可能会受到损伤，导致细胞功能的丧失。

在细胞复苏的过程中，细胞会启动一系列分子修复机制，修复受损的DNA和蛋白质。

具体来说，细胞会产生一些特定的酶，如DNA修复酶和蛋白质修复酶，来修复受损的分子。

这些酶可以修复DNA链断裂、修复DNA碱基上的氧化损伤、修复蛋白质的氨基酸缺失等。

通过这些修复机制，细胞可以逐渐恢复正常的的DNA结构和蛋白质功能。

此外，细胞复苏的过程还涉及到细胞内部的能量代谢。

在细胞复苏的过程中，细胞会逐渐恢复正常的能量代谢功能。

具体来说，细胞会逐渐恢复正常的ATP合成和氧化磷酸化代谢。

通过这些代谢过程，细胞可以产生足够的能量来维持正常的生理功能。

细胞复苏的过程是一个复杂而多步骤的过程，涉及到多个细胞内分子修复机制和能量代谢过程。

在这个过程中，环境条件的改变和提供必要的营养物质和氧气都是至关重要的。

尽管我们已经了解到了细胞复苏的一些基本原理，但是细胞复苏的具体机制仍然有待进一步深入研究。

深入了解细胞复苏的过程将会有助于我们更好地理解细胞的功能和疾病的发生机制，从而为疾病的治疗和预防提供重要的科学依据。

细胞复苏方法及要点一、准备所需工具和试剂在进行细胞复苏之前，需要准备以下工具和试剂：1. 冷冻细胞存储容器和液氮罐。

2. 37℃恒温水浴或复苏加热板。

3. 显微镜和细胞计数板。

4. 无菌的离心管、吸管和培养皿。

5. 无菌的细胞培养基和胎牛血清。

6. 无菌的PBS缓冲液或生理盐水。

7. 胰蛋白酶、EDTA或其它细胞分离消化试剂。

8. 无菌的细胞培养箱或孵育设备。

二、确认细胞状态良好在进行细胞复苏之前，需要确认细胞状态良好，包括细胞活性、数量和质量等方面。

可以通过显微镜观察细胞的形态、生长和繁殖情况，以及使用细胞计数板对细胞数量进行统计。

三、将细胞从冷冻容器中取出将冷冻细胞存储容器从液氮罐中取出，迅速将盖子打开，用无菌的吸管或注射器将细胞悬浮液吸出，并加入到无菌的离心管中。

注意不要让细胞沉淀在容器底部，以免影响细胞复苏效果。

四、用适当温度的复苏溶液洗涤细胞将无菌的复苏溶液加入到离心管中，轻轻摇动以混合均匀。

将混合液转移到无菌的培养皿中，用显微镜观察细胞的溶解情况。

如果细胞尚未完全溶解，可以轻轻搅拌或用吸管吹打均匀。

注意复苏溶液的温度要适当，以避免对细胞产生伤害。

五、离心去除复苏溶液将含有细胞的混合液转移到无菌的离心管中，进行离心分离。

离心速度和时间需要根据细胞的类型和状态进行适当调整。

去除上清液后，加入适量的新鲜细胞培养基，轻轻摇动以混合均匀。

六、用新鲜的细胞培养基重新悬浮细胞将重新悬浮的细胞转移到无菌的培养皿中，用显微镜观察细胞的生长和繁殖情况。

如果细胞贴壁生长，可以使用胰蛋白酶或EDTA进行消化分离，并重新悬浮到新鲜的细胞培养基中。

注意细胞浓度要适中，以避免细胞过度生长或竞争性抑制。

七、转移细胞至培养容器中将重新悬浮的细胞转移到无菌的培养容器中，包括细胞瓶、孔板或微孔板等。

根据需要设置不同的细胞浓度和培养条件，如温度、湿度、CO2浓度等。

注意培养容器的盖子要拧紧，以避免污染。

八、将细胞培养在适当的环境下将培养容器转移到无菌的培养箱或孵育设备中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。

细胞计数
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

1.将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上；
2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；
3.静置3分钟；
4.镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的,然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×稀释倍数×104
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

细胞计数板
细胞活力测定
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。

复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。

1.将细胞悬液以0.5ml加入试管中；
2.加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟；
3.死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

细胞存活率为：活细胞数÷总细胞数×100％。

注意：活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

细胞复苏及培养实验方法
一、准备细胞复苏所需物品
1.离心管
2.细胞计数板
3.移液管
4.细胞培养瓶
5.细胞冻存管
6.液氮
7.37℃水浴
8.培养基
9.血清
10.抗生素
二、细胞复苏步骤
1.从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中快速复苏。

2.待细胞冻存管外表面融化后，打开管盖，用移液管吸出细胞悬液，放入离心管中。

3.将离心管中的细胞悬液以适当的转速和时间离心，去除上清液。

4.离心后，用含有一定比例血清和抗生素的培养基重悬细胞，制成细胞悬液。

5.将细胞悬液均匀分装到细胞培养瓶中，放入培养箱中进行培养。

三、细胞培养步骤
1.将细胞培养瓶放入培养箱中进行培养，保持适宜的温度和湿度。

2.根据需要更换培养基，保持细胞生长所需的营养和生长因子。

3.根据细胞的生长情况，适时进行传代培养，保持细胞的生长活力和数量。

4.在培养过程中进行必要的细胞鉴定和表型检测，确保细胞质量和实验结果
的可靠性。

5.记录细胞的生长情况、传代次数和鉴定结果等信息，建立完整的细胞系档案。

注意事项：
1.在操作过程中要保持无菌操作，避免污染。

2.根据不同的细胞类型和实验需求，选择适宜的培养基、血清和生长因子。

3.定期检查细胞的形态、生长情况和传代情况，及时发现异常并进行处理。

细胞培养中细胞活力检测标准操作规程一、目的：建立用于细胞培养过程中染色排除法检测细胞活力的操作规范，以确保标准细胞在传代扩增前细胞活力达到一定标准。

二、范围：细胞复苏后冻存前三、仪器：超净工作台、倒置显微镜四、试剂及耗材：4%的台盼蓝染液、载玻片、盖玻片、计数器五、操作规程1.超净台紫外照射灭菌半小时，DMEM高糖完全培养基、1640完全培养基、PBS 溶液在37℃水浴锅中预热，0.25%胰酶平衡至室温。

2.从培养箱中取出培养至细胞丰度达80%以上的贴壁细胞的培养皿，用75%的乙醇喷洒后拿进超净台，用滴管移去培养皿中的培养液，用2mL的PBS溶液清洗细胞一遍，弃去，以洗掉残存的培养液。

3.用移液枪吸取2 mL 0.25%胰酶至培养皿中，轻轻摇晃使胰酶覆盖整个平皿，在显微镜下消化3-5 min，观察培养皿中的细胞直至细胞变圆，从培养皿脱落。

4.向培养皿中加入2 mL的DMEM高糖完全培养基，终止胰酶消化，用吸管吹打细胞至细胞成单分散状态。

将细胞悬液转移至15 mL离心管中，900 rpm离心3min，小心弃去全部上清液。

（若为悬浮细胞，上述步骤可省略。

用吸管轻轻吹打培养液后全部转移入15mL 离心管中，900 rpm离心4 min弃去上清即可。

）5.加入2mL PBS溶液将细胞沉淀吹打均匀，若为悬浮细胞，加入900µLPBS溶液稀释10倍；若为贴壁细胞，加入400µLPBS溶液稀释5倍。

6.取90µL稀释后的细胞悬液，按9:1的量加入10µL 0.4％台盼蓝染色液（终浓度为0.04%），充分混匀，静置3 min。

7.吸取10µL染色后的细胞悬液显微镜下观察，计数细胞总数及染色后细胞。

活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活力。

每种细胞测三次取平均。

活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%注意事项①染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使结果偏低。

细胞冻存和复苏的原则
1.保护细胞膜：细胞膜是细胞内部和外部环境之间的重要屏障，保护
细胞膜是冻存和复苏的关键。

冻存前，必须将细胞放入适当的保护剂中，
例如甘油、DMSO等，保护细胞膜免受冷冻过程中的损伤。

在复苏过程中，使用适当的解冻缓冲液缓慢地回温，避免细胞膜急剧收缩或破裂。

2. 控制冷冻速度：细胞冷冻的速度必须缓慢，以避免冻结引起的细
胞破坏。

最佳的冷冻速度取决于细胞类型和冷冻条件，通常应在-
1°C/min以下。

可以使用特殊的冷冻器进行控制，或通过降低温度梯度
来减缓细胞的冷冻速度。

3.恢复培养环境：在冻存的细胞复苏过程中，必须立即将细胞恢复到
培养环境中。

这包括向培养基中添加适当的营养物，例如葡萄糖、氨基酸、维生素等，在适宜的温度、氧气和二氧化碳条件下培养。

4.检测细胞的活力和质量：冷冻和复苏过程都会对细胞产生损伤，因
此必须定期检测细胞的活力和质量。

这可以通过测量细胞增殖率、形态、
细胞周期及细胞凋亡等生化和形态指标来评估。

总之，一个成功的细胞冻存和复苏过程需要考虑多个因素，包括保护
细胞膜、控制冷冻速度、恢复培养环境和检测细胞活力和质量。

只有通过
精心设计和执行这些步骤，才能最大限度地减小细胞冻存和复苏过程中的
损伤和质量损失。

细胞工程实验报告实验课程：细胞工程实验内容：细胞复苏及存活率测定一实验目的1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。

2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。

3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。

二实验原理在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。

但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。

因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。

血球计数板：血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。

H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。

计数室：每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）三、主要仪器试剂设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、离心管等。

试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。

四实验步骤（复苏）●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。

●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。

（细胞死活鉴定及计数）➢用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。

把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。

➢取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。

➢如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。

淋巴细胞的保存和活力测定一、分离细胞的保存在某些情况下，分离所得细胞需要加以保存，否则活力迅速下降，甚至死亡。

（一）短期保存技术将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的Hanks、Tc-1 99、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。

所用培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。

通常置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。

要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。

（二）长期冷冻保存技术利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，是当前世界上通用的细胞长期保存技术。

其原理在于深低温环境可中断细胞的代谢，但在降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变均可导致细胞的损伤和部分死亡，所以在冷冻过程中一定要加用冷冻保护剂，常用的保护剂为二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。

冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。

条件合适时，冻存细胞一旦复苏，恢复37℃培养，其形态和代谢活动均可恢复正常。

操作的原则是先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内，速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。

继而进行降温冷冻，目前常用两步降温法，即迅速降温至一选择好的临界温作为过渡站，如－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。

如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。

将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。

二、细胞活力测定细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。

细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypanblu e）染色法。

台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。