激光照射金纳米微粒靶向细胞对细胞膜通透性的影响

第４２卷第１２期　２００８年１２月　西安　交通大　学　学报　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＸＩ　ＡＮ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　Ｖｏ１．４２　Ｎｏ１２　

Ｄｅｃ．２ＯＯ８　

激光照射金纳米微粒靶向细胞对　

细胞膜通透性的影响　

姚翠萍，张镇西　（西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室，７１００４９，西安）　

摘要：利用光吸收性纳米微粒靶向选定细胞后，采用短脉冲激光照射可以得到局部的定位损伤，因　

此光吸收性纳米微粒作为媒介可诱导可控细胞微效应．激光照射结合有金纳米微粒的细胞可以暂　

时提高细胞膜的通透性．激光照射后，利用流式细胞仪，测量细胞对异硫氰酸荧光素葡聚糖和碘化　丙啶的吸收量来判断细胞膜的暂时通透性和细胞的死亡率．通过实验发现，对于Ｋａｒｐａｓ一２９９细胞，　

最高的转染率可以达到６５　以上．实验结果表明，细胞的死亡率和转染率受到金纳米微粒浓度、细　胞抗原蛋白和类型的影响．　

关键词：激光；金纳米微粒；细胞膜通透性；靶向性　

中图分类号：Ｒ３１８．１　５　文献标志码：Ａ　文章编号：０２５３—９８７Ｘ（２００８）１２—１５６０—０５　

Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｇｏｌｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｂｙ　Ｌａｓｅｒ　

Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｐｌａｓｍａ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　

ＹＡＯ　Ｃｕｉｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｅｎｘｉ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｘｉ　ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ　ａｎ　７１００４９，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｉｇｈｔ—ａｂｓｏｒｂｉｎｇ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｒｅ　ｈｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｈｏｒｔ　ｌａｓｅｒ　ｐｕｌｓｅｓ　ｔｏ　ｃｒｅａｔｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄａｍａｇｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ　ａｂｓｏｒｂｉｎｇ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｅｎａｂｌｅ　ｔｏ　ｃｒｅａｔｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｃｅｌｌｕ—　

ｌａｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｇｏｌｄ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｂｏｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ａｒｅ　ｈｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｈｏｒｔ　ｌａｓｅｒ　ｐｕｌｓｅｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ａｆｔｅｒ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　

ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ａｒｅ　ｐｒｏｂｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａ—　ｎａｔｅ　ｄｅｘｔｒａｎ　ｏｒ　ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅ　ｍａｘｉｍａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｃ—　ｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｆｏｒ　Ｋａｒｐａｓ一２９９　ｏｆ　６５　ｉＳ　ａｃｈｉｅｖｅｄ，ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　

ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｒｅｓｅａｌｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｉｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇｏｌｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏ—　

ｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ，ｔｏ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｂｏｕｎｄ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ￣ｌａｓｅｒ；ｇｏｌｄ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ；ｔａｒｇｅｔ　

在生物学和医学的很多应用中，需要把大分子　

送人哺乳细胞的细胞膜内，其中最重要的一个应用　

就是基因治疗．目前，把基因或者其他大分子送人细　胞的方法很多，包括化学、病毒以及物理方法，但是　这些方法都有其各自的缺点＿１］．由于激光技术和激　

光应用的不断发展，很多科学家把他们的目光转向　

了脉冲激光系统，并设法把它们应用到生物技术中．　利用激光进行细胞转染的方法目前有４种，微　粒靶向激光转染法是其中的一种．与其他方法相比，　微粒辅助激光转染法具有更大的发展潜力ｌ＿２］．在微　

粒辅助激光转染法的研究中，Ｙｕｋｉｈｉｒｏ和Ｐｉｔｓｉｌ—　

ｌｉｄｅｓ等人分别报道了他们利用激光照射橡胶微粒　

和金纳米微粒细胞而使外源分子进人生物细胞的研　究结果＿＿３　］．由于金纳米微粒与橡胶微粒相比具有更　

好的局部损伤性，但对于金纳米微粒在这个方面的　

研究很不深入，国内目前还没有见到相关报道．　

收稿日期：２００８—０３—１８．　作者简介：姚翠萍（１９７１一），女，讲师．　基金项目：国家自然科学基金资助项目（６０５７８Ｏ２６）

　第１２期　姚翠萍，等：激光照射金纳米微粒靶向细胞对细胞膜通透性的影响　

基于上述原因，本文使用了实验室现有的、具有　特定相同抗原的Ｌ一４２８和Ｋａｒｐａｓ一２９９两种细胞系，　

针对不同的微粒直径、不同的脉冲能量以及不同的　

微粒浓度，对微粒辅助激光照射方法影响细胞膜通　透性的程度做了深入的实验研究．　

１材料和方法　

１．１仪器设备　本文中所有实验使用的激光是波长为５３２　ｒｌｍ、　脉宽为６　ｎｓ的Ｑ一开关倍频Ｎｄ：ＹＡＧ激光（Ｓｕｒｅ—　

ｌｉｔｅ　Ｉ，Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ，ＣＡ，ＵＳＡ），其光强为高斯分　

布，输出能量稳定度具有１Ｏ　的方差，激光光束直　径为２　ｍｍ并直接照射样品．在光束中间当每个脉　

冲能量为ｌ　ｍＪ时，激光的能量密度可以达到０．０３　Ｊ／ｃｍ　，并随激光能量线性增加．实验中，脉冲的频　

率都为２０　Ｈｚ，所使用的样品池专门定做（Ｈｅｌｌｍａ），　

在规格为２５　ｍｍ×７５　ｍｍ的一片玻璃板上制作了　直径为２　ｍｍ的１８个样品池，每次做实验时样品量　

为４．０　Ｌ．细胞膜的通透性和死亡率分别用流式细　胞仪（ＦＡＣＳＣＡＮ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）测量加入的　

异硫氰酸荧光葡聚糖（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｄｅｘｔｒａｎ（ＦＩＴＣ—Ｄ），分子质量１０　０００　Ｄａｌｔｏｎｓ，分子　

探针，Ｓｉｇｍａ公司，０．１　ｍｏｌ／Ｌ）和碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉ—　

ｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ），Ｓｉｇｍａ公司，０．０２　ｍｏｌ／Ｌ）的荧光强　度来确定．每个样品中检测５　０００个细胞，所采集的　数据存储起来并应用ＷｉｎＭＤＩ　２．８软件处理．同时，　

用荧光显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ　ＢＨ２～ＲＦＬ—Ｔ２）对实验　

结果进行观测，并用数码相机拍摄照片．　１．２细胞培养　

Ｋａｒｐａｓ一２９９（人类恶性淋巴瘤细胞）、Ｌ一４２８细　胞（Ｈｏｄｇｋｉｎ’Ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ细胞）均由柏林富兰克林本　

杰明学院烧伤病理科的Ｈｏｒｓｔ　Ｄｔｉｒｋｏｐ提供．这两种　细胞都是悬浮生长在含有Ｈｅｐｅｓ和Ｌ一谷氨酸盐并　

加入了１Ｏ　的胎牛血清、抗生素和抗菌药物（ａｎｔｉ～　

ｂｉｏｔｉｃ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１００×）的ＲＰＭＩ一１　６４０（１　×）的培养基中（所有这些培养基都是从奥地利　

Ｐａｓｃｈｉｎｇ　ＰＡＡ实验室购买），并置于培养箱中进行　

培养，环境为３７。Ｃ，ＣＯ　与空气的摩尔分数分别为　５　、９５　，湿度为９５　９／６～１００　．　

１．３实验方法　细胞达到指数增长期时，从培养皿中取出细胞　并对细胞进行计数，然后取出一定量的细胞溶液，以　

ｌ　４００　ｒ／ｍｉｎ的速度在２Ｏ℃条件下离心５　ｍｉｎ，重新　

以一定的密度（细胞密度为４×１０　个／ｍＬ或２×　１０　个／ｍＬ）悬浮于磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）中．接着加　

入一定浓度的由１５　ｎｍ、３０　ｒｉｍ胶体金和对应于　ＣＤ３０的ＢｅｒＨ２抗体、对应于ＣＤ２５的ＡＣＴ１抗体　

组成的免疫金颗粒，在培养箱中３７。Ｃ下培养２０　ｍｉｎ．在临照射前，加人ＦＩＴＣ—Ｄ　０．１　ｍｏｌ／Ｌ．把细胞、　

纳米微粒和ＦＩＴＣ—Ｄ的混合液移人样品池进行照　

射．照射结束后，把样品池重新放人培养箱中培养至　

少３Ｏ　ｍｉｎ后，用ＰＢＳ冲洗一遍并悬浮于包含有ＰＩ　的ＰＢＳ中，用流式细胞仪和荧光显微镜测量细胞的　

荧光以判断细胞膜的通透性和细胞的死亡率．为了　

得到对于细胞膜通透性提高最优的实验条件，在实　验中分别应用了不同的能量以及相同能量不同脉冲　

数目的激光照射样品，通过比较两种不同的细胞系　以证实这种方法的普遍性．　

２　实验结果　

２．１　两种细胞与ＢｅｒＨ２金微粒结合后细胞膜的通　

透性　实验中Ｋａｒｐａｓ一２９９和Ｌ一４２８两种细胞分别通　

过ＢｅｒＨ２抗体与３０　ｎｍ金微粒结合，细胞浓度为２　

×１０　个／ｍ　Ｌ－采用一个脉冲不同能量激光照射后，　

通过流式细胞仪测量到的细胞死亡率和转染率如图　ｌ所示，其中ＦＩＴＣ—Ｄ和ＰＩ都不会进入未受到任何　损伤的细胞，发生细胞膜暂时通透性的细胞只有　ＦＩＴＣ＿Ｄ可以进入，损伤细胞或者死亡细胞在照射　

３０　ｒａｉｎ后仍然可以看到ＰＩ进入细胞，或者两者都　会进入细胞．图２给出的是细胞暂时通透率和死亡　

率的统计比较结果．随着辐照激光能量的增加，细胞　的损伤率（右上区域）和膜的暂时通透率（右下区域）　

都会提高．由于低吸收率和较强的热效应，与３０　ｎｍ　

的金微粒相比，采用１５　ｎｍ的金微粒时，需要更高　的能量才能导致细胞受损，并提高细胞膜的暂时通　透性．　当每个脉冲的能量为２．５　ｒｎＪ时，采用不同数目　

的激光脉冲照射，细胞结合３０　ｎｍ金微粒时所得到　的结果如图３所示．从结果可以看出，当脉冲数目大　

于５时，脉冲的数目与结果并没有明显的线性关系，　

ＦＩＴＣ－Ｄ和ＰＩ荧光强度增加量的变化只有在１～５　个脉冲之间的变化比较明显．　２．２　Ｋａｒｐａｓ一２９９细胞通过ＡＣＴ１抗体与金纳米微　

粒结合　由于Ｋａｒｐａｓ一２９９细胞更容易出现膜的通透性，　并且可以分别通过两种抗体结合金微粒，因此在下　

文中主要对这个细胞进行讨论．为了找到最佳的实　西安交通大学学报　第４２卷　

褂　

＾　褂　辩　糌　Ｕ　

＾　槲　髁　！０４　

１０，　靛　羹１０　

岛１０　・　≥　

２　３８％　２　３８％　

８７．１０％　０．６４％　１Ｏ０　１Ｏｌ　ｌ０　１０３　１０　ＦＩＴＣ．Ｄ的荧光相对强度　

（ａ）未照射　

（ｃ）７．５　ｒｒｄ　１０４　

１０，　

霎１０　

ｇ　１０１　山　．　参　一０载　０　１　０　撞　０　０　８．７８％　

１００　１０ｌ　１０２　ｉ０３　１０　ＦＩＴＣ．Ｄ的荧光相对强度　

（ｂ）２．５　ｒｒｄ　

１Ｏ４　

筌１０３　靛　萎１０２　

善１０’　

ｌ０Ｏ　ｌＯ　１Ｏ２　１Ｏ３　ｌＯ　ＦＩＴＣ．Ｄ的荧光相对强度　

（ｄ）１０　ｍＪ　１０４　

餐１０　靛　霎１０　

蕊１０’　囊　

１Ｏ０　１０ｌ　１０２　１０３　１０４　ＦＩＴＣ．Ｄ的荧光相对强度　

（ｃ）５　ｍＪ　

】Ｏ　篓ｌ　ｏ３　靛　藁１０２　

誉１０　一。　‘　謦　

簿　

一　：　１．２６％．｛　．　．９．３４％　ｌ００　１０ｌ　ｌ０２　１０３　１０４　ＦＩＴＣ　Ｄ的荧光相对强度