1294 环球中医药2023年7月第16卷第7期 Global Traditional Chinese Medicine,July 2023,Vol.16,No.7㊃辨证保健专题㊃基金项目:国家重点研发计划(2018YFC1706803)作者单位:102488 北京中医药大学中医学院[李丽(硕士研究生)㊁刘佳琪(硕士研究生)㊁冯颖童(硕士研究生)㊁扈觐玺(硕士研究生)㊁姜斯佳(博士研究生)㊁贾岚㊁王景霞];北京中医药大学第三附属医院内分泌科(高晶)作者简介:李丽(1996-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向:中药基础理论㊂E⁃mail:1527874193@ 通信作者:王景霞(1976-),博士,教授,博士生导师㊂研究方向:中药药性理论㊂E⁃mail:wjx20131210@桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠肝脏ACC1/FASN /SCD1信号通路及GLUT2的影响李丽 刘佳琪 冯颖童 扈觐玺 姜斯佳 高晶 贾岚 王景霞【摘要】 目的 研究桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠肝脏组织乙酰辅酶A 羧化酶1(Acetyl⁃coa carboxylase 1,ACC1)/脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)/硬脂酰⁃辅酶A 去饱和酶1(stearoyl⁃CoA desaturase 1,SCD1)通路及葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter2,GLUT2)的影响㊂方法 雄性SD 大鼠48只,根据基础血糖水平分为空白组㊁模型组㊁阳性药组㊁桑芪益气养阴方低㊁中㊁高剂量组㊂采用甲状腺素皮下注射㊁连续高脂饲料喂养合并链脲佐菌素注射复合因素造模㊂空白组大鼠不予给药,模型组大鼠给予给予0.9%氯化钠溶液,阳性药组十味消渴胶囊灌胃剂量为1.32g /kg㊁桑芪益气养阴方低㊁中㊁高剂量组灌胃剂量分别为1.25㊁2.5㊁7.5g /kg㊂连续给药30天,比色法检测大鼠外周血谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)㊁谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)和肝脏肝糖原㊁游离脂肪酸(free fat acid,FFA)㊁丙二醛(malondi⁃aldehyde,MDA)㊁超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)㊁谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH⁃Px)含量,使用RT⁃PCR 及Western blot 分别检测大鼠ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2的mRNA 和蛋白表达㊂结果 与空白组相比,模型组大鼠ALT㊁AST㊁MDA 显著升高,SOD㊁肝糖原㊁GSH⁃PX 显著降低(P <0.05,P <0.01),ACC1㊁FASN㊁SCD1的mRNA 和蛋白表达水平显著升高,GLUT2的mRNA 和蛋白表达水平显著降低(P <0.01);与模型组比较,各干预组大鼠ALT㊁AST㊁MDA 显著降低,SOD㊁肝糖原㊁GSH⁃PX 显著升高(P <0.05,P <0.01),桑芪益气养阴方中㊁高剂量组FFA 含量显著降低(P <0.05,P <0.01),桑芪益气养阴方中㊁高剂量组ACC1㊁FASN㊁SCD1的mRNA 和蛋白表达水平显著降低(P <0.01),GLUT2的mRNA 和蛋白表达水平显著升高(P <0.01)㊂结论 桑芪益气养阴方可调节大鼠肝脏糖脂代谢紊乱,缓解氧化应激,预防肝损伤,其机制可能与抑制ACC1/FASN /SCD1和上调GLUT2基因和蛋白表达相关㊂【关键词】 桑芪益气养阴方; 气阴两虚证; 胰岛素抵抗; 氧化应激; 肝脏糖脂代谢【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.07.003Effects of Sangqi Yiqi Yangyin Fomula leaves on ACC1/FASN /SCD1pathway and GLUT2in liver of insulin resistance ratsLI Li ,LIU Jiaqi ,FENG Yingtong ,HU Jinxi ,JIANG Sijia ,GAO Jing ,JIA Lan ,WANG Jingxia School of Traditional Chinese Medicine ,Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 102488,China Corresponding author :WANG Jingxia ,E⁃mail :wjx20131210@【Abstract 】 Objective To study the effects of Sangqi Yiqi Yangyin Fomula on ACC1/FASN /SCD1pathway and GLUT2in insulin resistant rats.Methods According to the basal blood glucose level,a totalof 48male Sprague Dawley rats were divided into blank group,model group,positive drug group (Shiwei环球中医药2023年7月第16卷第7期 Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.71295 Xiaoke Capsule),and low,medium and high dose groups of Astragalus mulberry leaf and Yuzhu granules. Subcutaneous injection of thyroxine combined with intraperitoneal injection of STZ was used to establish a hyperglycemic rat model of insulin resistance.The gavage dose of the model group was0.9%sodiumchloride solutionn,the gavage dose of the Shiwei Xiaoke capsule positive drug group was1.32g/kg,andthe gavage dose of the Huangqi Mulberry Ye Yuzhu granule low,middle and high dose groups were1.25,2.5and7.5g/kg.Continuous administration for30days,The contents of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in peripheral blood and glycogen,free fat acid(FFA), malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH⁃PX)in liver were determined by colorimetry,the mRNA and protein expressions of Acetyl⁃coa carboxylase1(ACC1),fattyacid synthase(FASN),stearoyl⁃CoA desaturase1(SCD1)and glucose transporter2(GLUT2)in rat liverwere detected by RT⁃PCR and Western blot.Results Compared with the blank group,ALT,AST,MDA,FFA,GLUT2were significantly increased in the model group;the levels of SOD,liver glycogen,GSH⁃Px,ACC1,FASN,SCD1were significantly decreased(P<0.05,P<0.01).Compared with the model group,the levels of ALT,AST,MDA and GLUT2were significantly decreased in the Shiwei Xiaoke group and thelow,medium and high dose groups of Sangqi Yiqi Yangyin Fomula;the levels of SOD,liver glycogen,GSH⁃Px,ACC1,FASN and SCD1were significantly increased(P<0.05,P<0.01).FFA was significantly decreased in the medium and high dose groups of Sangqi Yiqi Yangyin Fomula(P<0.05,P<0.01).Conclusion Sangqi Yiqi Yangyin Fomula can regulate the disorder of hepatic glucose and lipid metabolism,relieve oxidative stress,and prevent liver injury in rats,and the mechanism may be related tothe inhibition of ACC1/FASN/SCD1pathway and GLUT2gene and protein expression.【Key words】 Sangqi Yiqi Yangyin Fomula; Qi and Yin deficiency syndrome; Insulin resistance; Oxidative stress; Hepatic glucose and lipid metabolism 胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要发病机制,并贯穿疾病全程㊂肝脏是胰岛素作用的重要靶器官,其对胰岛素的低敏感性是推动2型糖尿病发展的关键环节[1]㊂正常生理状态下,胰岛素能调节肝脏中糖原㊁脂类㊁蛋白质等生物大分子的合成,抑制糖异生,维持血糖稳态[2];胰岛素抵抗状态下肝脏糖异生抑制受损,而脂肪合成仍保持较高水平,表现为肝脏脂肪酸和甘油三酯水平升高[3]㊂肝脏内脂质积累造成肝脏氧化应激和功能受损,进一步加重胰岛素抵抗,因此,缓解肝脏胰岛素抵抗为防治2型糖尿病的重点㊂中医学以整体观㊁辨证论治理念为指导,在糖尿病等慢性病防治方面独具优势㊂就中医而言,2型糖尿病当以消渴论治,其病机演变常遵循 阴虚-气阴两虚-阴阳两虚”这一规律,而气阴两虚是贯穿全病程的根本病机,也是病理转机的关键,故益气养阴法当为消渴病治疗的基本大法[4]㊂桑芪益气养阴方为结合中医辨证理论及临床经验,由黄芪㊁桑叶㊁玉竹㊁葛根㊁蜂胶粉组合而成,用于气阴两虚证消渴患者㊂前期课题组实验研究表明[5],该方除改善气阴两虚型糖尿病大鼠的证候表征外,还可使模型大鼠的空腹血糖和胰岛素抵抗指数显著降低,使空腹胰岛素㊁胰岛素敏感指数㊁胰岛β细胞功能指数显著升高,在改善高血糖大鼠糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗方面疗效显著㊂本研究进一步探究桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠的肝脏保护作用,并从乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl-coa carboxylase1,ACC1)/脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)/硬脂酰-辅酶A去饱和酶1(stearoyl⁃CoA desaturase1,SCD1)信号通路及葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter2,GLUT2)表达等角度,探究其可能的作用机制,为临床应用提供科学的实验支持㊂1 材料与方法1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠48只,体质量(220±20)g㊂购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2016⁃0006,本研究经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会批准(批准号: BUCM⁃4⁃2021052405⁃2038)㊂大鼠于北京中医药大学动物房常规饲养,饲养条件:室温22~24℃㊁相对湿度60%~70%㊁光照节律12L:12D㊂由北京斯贝福生物技术有限公司提供特殊高脂饲料,配比为猪1296 环球中医药2023年7月第16卷第7期 Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.7油10%㊁蔗糖15%㊁蛋黄粉15%㊁酪蛋白5%㊁胆固醇1.2%㊁胆酸钠0.2%㊁碳酸氢钙0.6%㊁石粉0.4%㊁鼠维持饲料52.6%㊂1.2 实验药物桑芪益气养阴方由黄芪㊁桑叶㊁玉竹㊁葛根㊁蜂胶粉按照4∶2.5∶3∶4∶0.3配比而成,购自安徽亳州市京皖中药饮片厂㊂制备方法:全方饮片分别用10倍㊁8倍的加水量煎煮2次,每次2小时,合并2次的滤液,加热浓缩,真空干燥后打粉,使用前用蒸馏水配制成相应浓度的药液㊂十味消渴胶囊(天津中新药业集团股份有限公司,国药准字号: Z19990033)㊂1.3 实验试剂L⁃甲状腺素钠(美国BioRuler公司,批号: r5703);链脲佐菌素(美国Sigma公司,批号: 102364684);Trizol(美国Ambion公司,批号:15596⁃026),HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR,HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR,SYBR Green Master Mix购于南京诺唯赞公司,批号分别为: R223⁃01㊁R223⁃01㊁Q111⁃02;Taq Plus DNA Polymerase,DL2000DNA Marker,dNTP购于北京天根生化科技有限公司,批号分别为:ET105⁃01㊁MD114⁃02㊁CD117㊂蛋白marker(10⁃250KD)(北京海利克思科技有限公司,批号:P12103⁃2);蛋白marker(20⁃120KD)(南京金斯瑞生物科技有限公司,批号:M00521);PVDF膜(0.45μm)(美国Millipore公司,批号:IPVH00010);兔多抗GAPDH (37KD)(杭州贤至生物有限公司,批号:AB⁃P⁃R001);兔多抗ACC1(250KD)㊁兔多抗FASN (272KD)购于武汉三鹰生物技术有限公司,批号分别为:21923⁃1⁃AP㊁10624⁃2⁃AP;兔单抗SCD1 (42KD)(英国Abcam公司,批号:ab236868);兔多抗GLUT2(57KD)(美国Affinity公司,批号: DF7510)㊂1.4 实验仪器台式高速冷冻离心机(德国Centrifuge公司, TY2017005846),水浴锅(姜堰市天力医疗器械厂有限公司,TL⁃420D),全自动研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限公司,KH⁃III),酶标检测仪(美国Biotek公司,Epoch2C),全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技有限公司,Chemray240),冰冻切片机(美国Thermo公司,Cryotome E),切片刀(上海徕卡仪器有限公司,Leica819),成像系统(日本尼康株式会社,Nikon DS⁃U3),电泳仪(DYY⁃7C)㊁垂直电泳槽(DYCZ⁃24DN)㊁电转仪(DYCZ⁃40)购于北京六一仪器厂㊂1.5 实验方法1.5.1 动物分组及给药 雄性SD大鼠48只,适应性喂养5天后,禁食不禁水12小时,测定给葡萄糖前(即0小时)大鼠血糖值㊁给予2.5g/kg葡萄糖后大鼠0.5小时和2小时血糖值为基础值,以0㊁0.5小时基础血糖水平将48只大鼠平均分为6个组,即空白组㊁模型组㊁阳性药组(十味消渴胶囊)㊁桑芪益气养阴方低㊁中㊁高剂量组,每组8只㊂连续30天进行大鼠灌胃给药,给药体积为1mL/100g,阳性药组给药剂量为十味消渴胶囊1.32g/kg㊁桑芪益气养阴方低㊁中㊁高剂量组灌胃药物剂量分别为1.25㊁2.5㊁7.5g/kg,空白组㊁模型组灌胃同等体积生理盐水㊂1.5.2 造模方法 建立由高脂饲料喂养㊁甲状腺素(tetraiodothyronine,T4)皮下注射㊁联合链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射造成胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱大鼠模型[6]㊂适应性喂养5天后开始造模,造模周期维持30天,空白组给予维持料饲养,其余各组均给予高热能饲料;除空白组外,其余各组在实验第21~27天下午14﹕00进行上颈部皮下注射T4混悬液(0.2mg/kg);在实验第28天除空白组外,各组禁食24小时(不禁水),在实验第29天以1mL/100g体质量的剂量一次性腹腔注射2%STZ 溶液(30mg/kg),注射后继续给予高热能饲料饲养5天,实验结束后取材㊂1.5.3 血液及肝脏样本制备 在实验第35天,各组大鼠禁食不禁水16小时,第36天早晨,采用腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.5mL/100g)麻醉大鼠,腹主动脉取血,室温静置2小时后4℃3500r/min,10分钟离心,取上层血清,-80℃保存㊂取肝大叶分装冻存管转移至液氮冻存,-80℃冰箱存放㊂1.6 指标检测1.6.1 血清生化分析及肝脏中游离脂肪酸(free fat acid,FFA)㊁丙二醛(malondialdehyde,MDA)㊁超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)㊁肝糖原㊁谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH⁃Px)的测定 采用比色法在全自动生化仪上测各组大鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)㊁谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的浓度变化;采用比色法测各组大鼠肝脏中肝糖原㊁FFA㊁环球中医药2023年7月第16卷第7期 Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.71297MDA㊁SOD㊁GSH⁃Px含量㊂1.6.2 RT⁃qPCR检测大鼠肝脏组织ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2的mRNA表达 从-80℃超低温冰箱取大鼠肝脏组织,每组随机选取3个大鼠肝脏样本, Trizol法提取总RNA,将干燥后的RNA溶解于20μL DEPC水中,取2μL定量测试OD260㊁OD280,余量留待逆转录㊂以总RNA为模板合成cDNA,进行聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)反应㊂扩增条件:95°C10分钟;95°C 15秒,60°C60秒,循环40次;95°C15秒,60°C1分钟,95°C15秒㊂在PCR扩增结束后,以2-ΔΔCt表示mRNA相对表达量㊂引物序列见表1㊂表1 引物序列表基因名称引物序列(5'-3')长度(bp)ACC1F:TGAAGGGCTACCTCTAATGR:CAAGCGGATGTAGACTGG337FASN F:GCTTCGCCAACTCTACCAR:ATCGCTTCCAAGATAATGC105SCD1F:GTGGGTTGGCTGCTTGTGCR:TCCCGAGATTGAATGTTCTTGTC308GLUT2F:AGTCACACCAGCACATACGAR:AGAGGGCTCCAGTCAACGA209GAPDH F:ACAGCAACAGGGTGGTGGACR:TTTGAGGGTGCAGCGAACTT252 1.6.3 Western Blot检测大鼠肝脏组织ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2蛋白表达 每组随机选取3个大鼠肝脏样本,按试剂盒法提取细胞总蛋白,蛋白定量法(Bicinchoninic acid,BCA)测定蛋白浓度㊂取蛋白样品进行SDS⁃PAGE电泳,转膜,封闭㊂用ACC1(1∶1000㊁FASN(1∶1000)㊁SCD1(1∶1 000)㊁GLUT2(1∶1000)㊁GAPDH(1∶1000)一抗,4℃孵育过夜,PBST洗膜5次,二抗(1∶10000),室温孵育2小时,PBST洗膜5次,显色曝光,image⁃pro plus分析胶片条带灰度值㊂1.7 统计学方法实验数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SAS9.4软件进行统计分析,数据进行正态分布及方差齐性检验㊂数据呈正态分布,组间数据比较用单因素方差分析(One⁃way ANOVA)分析,两两比较方差齐时采用LSD进行统计分析;方差不齐采用Dunnett’s T3进行统计分析㊂各统计结果以P<0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠血清ALT㊁AST的影响与空白组相比,模型组大鼠ALT显著升高(P<0.01)㊂与模型组比较,阳性药组大鼠ALT㊁AST显著升高(P<0.01),桑芪益气养阴方各剂量组ALT均显著降低(P<0.01),桑芪益气养阴方中㊁高剂量组AST显著降低(P<0.01)㊂见表2㊂表2 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠ALT㊁AST的影响(x±s,U/L)组别鼠只ALT AST空白组840.38±6.70160.08±22.49模型组862.50±8.30a173.06±29.74阳性药组837.00±4.44b117.33±18.72b 桑芪益气养阴方低剂量组848.13±11.13b165.28±14.31桑芪益气养阴方中剂量组843.38±7.29b126.08±21.45b 桑芪益气养阴方高剂量组840.38±7.25b114.35±24.38b 注:与空白组比较,a P<0.01,与模型组比较,b P<0.01㊂2.2 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠肝脏肝糖原和FFA的影响与空白组相比,模型组大鼠肝脏肝糖原显著降低(P<0.01),FFA显著升高(P<0.05)㊂与模型组比较,阳性药组和桑芪益气养阴方各剂量组大鼠肝脏肝糖原均显著升高(P<0.05,P<0.01),桑芪益气养阴方中㊁高剂量组大鼠肝脏FFA显著降低(P<0.05,P<0.01)㊂见表3㊂表3 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠肝脏肝糖原和FFA的影响(x±s)组别鼠只肝糖原(mg/g)FFA(U/mL)空白组839.44±1.65 1.43±0.18模型组827.19±3.11b 1.73±0.35a阳性药组834.79±3.86c 1.93±0.32桑芪益气养阴方低剂量组833.14±2.28c 1.74±0.22桑芪益气养阴方中剂量组833.90±4.00c 1.28±0.18d 桑芪益气养阴方高剂量组838.85±1.43d 1.42±0.31c 注:与空白组比较,a P<0.05,b P<0.01;与模型组比较,c P<0.05,d P<0.01㊂2.3 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠肝脏MDA㊁SOD㊁GSH⁃Px的影响与空白组相比,模型组大鼠肝脏SOD㊁GSH⁃PX 显著降低,MDA显著升高(P<0.01)㊂与模型组比1298 环球中医药2023年7月第16卷第7期 Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.7较,阳性药组大鼠肝脏MDA显著降低,SOD㊁GSH⁃PX显著升高(P<0.01)㊂桑芪益气养阴方各剂量组大鼠肝脏SOD㊁GSH⁃PX显著升高,MDA显著降低(P<0.01)㊂见表4㊂2.4 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠肝脏ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2mRNA表达的影响与空白组比较,模型组大鼠ACC1㊁FASN㊁SCD1 mRNA表达显著升高(P<0.01),GLUT2mRNA表达显著降低(P<0.01)㊂与模型组比较,阳性药组和桑芪益气养阴方低㊁中剂量组大鼠ACC1㊁FASN㊁SCD1 mRNA表达显著降低(P<0.01),GLUT2mRNA表达显著升高(P<0.01)㊂见表5㊂2.5 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠肝脏ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2蛋白表达的影响与空白组比较,模型组大鼠ACC1㊁FASN㊁SCD1蛋白表达显著升高(P<0.01),GLUT2蛋白表达显著降低(P<0.01)㊂与模型组比较,阳性药组大鼠ACC1㊁FASN㊁SCD1蛋白表达显著降低(P<0.01), GLUT2蛋白表达显著升高(P<0.01);桑芪益气养阴方各剂量组大鼠FASN㊁SCD1蛋白表达均显著降低(P<0.01),桑芪益气养阴方中㊁高剂量组大鼠ACC1蛋白表达显著降低,GLUT2蛋白表达显著升高(P<0.01)㊂见表6,图1㊂表4 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠MDA㊁SOD㊁GSH⁃Px的影响(x±s,U/mL)组别鼠只MDA SOD GSH⁃Px空白组854.12±10.81884.19±46.95695.49±90.66模型组893.10±4.51a677.17±41.82a288.83±97.22a阳性药组852.78±6.20b769.83±16.62b542.68±111.67b 桑芪益气养阴方低剂量组861.70±5.97b817.24±33.39b519.95±74.44b 桑芪益气养阴方中剂量组856.36±8.46b817.22±54.32b564.98±69.67b 桑芪益气养阴方高剂量组849.22±4.91b869.06±24.21b537.56±116.03b 注:与空白组比较,a P<0.01;与模型组比较,b P<0.01㊂表5 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2基因表达的影响(x±s)组别鼠只ACC1FASN SCD1GLUT2空白组30.478±0.1300.293±0.0350.415±0.124 2.407±0.111模型组3 1.010±0.153a0.954±0.042a 1.009±0.048a0.965±0.042a阳性药组30.877±0.072b0.782±0.038b0.892±0.092b 1.236±0.134b 桑芪益气养阴方低剂量组30.486±0.084b0.486±0.034b0.564±0.064b 2.213±0.112b 桑芪益气养阴方中剂量组30.620±0.025b0.555±0.079b0.702±0.115b 1.457±0.218b 桑芪益气养阴方高剂量组30.922±0.0850.810±0.0440.919±0.057 1.136±0.036注:与空白组比较,a P<0.01;与模型组比较,b P<0.01㊂表6 桑芪益气养阴方对胰岛素抵抗大鼠ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2蛋白表达的影响(x±s)组别鼠只ACC1FASN SCD1GLUT2空白组30.439±0.0410.291±0.0310.239±0.0270.661±0.081模型组30.787±0.085a0.686±0.090a0.666±0.081a0.205±0.022a阳性药组30.562±0.052b0.455±0.047b0.360±0.019b0.408±0.026b 桑芪益气养阴方低剂量组30.642±0.0440.525±0.020b0.541±0.031b0.259±0.014桑芪益气养阴方中剂量组30.483±0.029b0.421±0.037b0.430±0.013b0.325±0.015b 桑芪益气养阴方高剂量组30.524±0.040b0.368±0.044b0.292±0.027b0.507±0.019b 注:与空白组比较,a P<0.01;与模型组比较,b P<0.01㊂环球中医药2023年7月第16卷第7期 Global Traditional Chinese Medicine,July 2023,Vol.16,No.71299 注:A 空白组;B 模型组;C 阳性药组;D 桑芪益气养阴方低剂量组;E 桑芪益气养阴方中剂量组;F 桑芪益气养阴方高剂量组㊂图1 各组胰岛素抵抗大鼠肝脏ACC1㊁FASN㊁SCD1㊁GLUT2蛋白条带表达情况图3摇讨论胰岛素抵抗是导致2型糖尿病的重要病理机制之一,同时也是非酒精性脂肪肝㊁高脂血症㊁动脉粥样硬化等疾病的共同危险因素㊂胰岛素抵抗的分子机制主要有糖毒性㊁脂毒性㊁氧化应激等,导致胰岛素受体信号转导异常㊂肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官及糖脂代谢的重要器官,肝脏胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生发展中起着举足轻重的作用[7]㊂GLUT2是一种跨膜载体蛋白,是肝脏和血液之间葡萄糖转移的主要转运体,可调节葡萄糖跨细胞膜运动,维持血糖稳定㊂胰岛素抵抗情况下,GLUT2蛋白表达减少,肝细胞葡萄糖摄取减少,可导致血糖升高[8];反之,肝脏GLUT2表达水平上调可促进肝组织对血液中葡萄糖的摄取,降低血糖水平[9]㊂前期研究显示,桑芪益气养阴方能显著降低气阴两虚型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗指数,本研究结果显示桑芪益气养阴方还能显著抑制胰岛素抵抗环境下肝脏GLUT2蛋白的减少,增加肝糖原合成,从而降低血糖水平㊂胰岛素抵抗加速脂肪组织分解并刺激肝脏脂肪合成,引起脂质代谢紊乱㊂脂肪组织加速分解,血液中大量游离脂肪酸流入肝脏,肝脏游离脂肪酸含量增加[10];另外,胰岛素抵抗过度刺激脂质的从头合成(de novo lipogenesis,DNL)并使肝脏脂质合成长期亢进[11]㊂DNL 是肝脏脂质合成的重要途径,在维持血清甘油三酯稳态方面发挥重要作用[12]㊂ACC1㊁FASN 和SCD1是DNL 的三个关键酶㊂葡萄糖经糖酵解,在三羧酸循环中产生柠檬酸盐,CoA 在ATP 柠檬酸裂解酶的作用下释放,后经ACC1催化并转化生成丙二酰辅酶A,FASN 以丙二酰辅酶A 为底物合成棕榈酸酯,SCD1催化棕榈酸酯发生去饱和反应并延长,产生复杂脂肪酸[13],造成肝脏内甘油三酯过度沉积㊂本研究显示,桑芪益气养阴方可减少肝脏游离脂肪酸含量,并通过下调胰岛素抵抗大鼠肝脏组织的ACC1㊁FASN㊁SCD1mRNA 和蛋白表达,抑制DNL 的过度激活,减少肝脏脂质沉积,改善脂代谢紊乱㊂氧化应激为肝脏糖脂代谢紊乱与肝脏胰岛素抵抗㊁肝功能受损中间环节㊂高血糖状态下氧化应激,一方面葡萄糖自身氧化作用增加,产生大量自由基;另一方面长期高血糖使多种蛋白质发生糖基化,形成糖基化终产物,过程中有大量自由基产生,其中SOD㊁GSH⁃Px 等抗氧化酶的糖基化及活性下降加剧了氧化与抗氧化作用的失衡[14]㊂此外,过量游离脂肪酸在肝细胞线粒体内发生β氧化,影响线粒体的活性,使脂肪酸转化为甘油三酯沉积在肝细胞中,肝脏脂质过量沉积加剧肝细胞氧化应激反应,产生过多的自由基与活性氧,导致脂质过氧化反应[15],并在反应末端产生MDA,并消耗SOD㊁GSH⁃Px 等多种抗氧化酶,从而引起蛋白质㊁核酸等生命大分子的交联聚合,使细胞丧失功能,引起肝脏细胞凋亡,从而导致肝脏功能紊乱[16]㊂本研究结果显示桑芪益气养阴方可缓解肝脏氧化应激,从而改善胰岛素抵抗并保护肝功能㊂从中医角度看,在2型糖尿病的发展过程中,脾虚气少,津不上承则气阴两虚,脾失健运,不能转谷为精,则湿浊内停,这与现代医学中促进胰岛素抵抗 糖毒” 浊毒” 氧化应激产物”等相似[17]㊂中医在健脾益气养阴的同时,必注重激浊扬清,化湿还津㊂桑芪益气养阴方中黄芪健脾补气,益气养阴;桑叶清热润燥养阴,生津止渴;葛根健脾益气,升举清阳;玉竹甘寒质润,益胃生津;蜂胶补虚弱,化浊脂,止消渴㊂诸药合用,中州得健,纳运有常,清阳得升,浊阴得降,湿浊得化,津液得复,则消渴得愈㊂现代药理研究显示,黄芪[18]㊁桑叶[19]㊁葛根[20]㊁玉竹[21]㊁蜂胶[22]均有确切的降糖作用㊂本实验研究显示,桑芪益气养阴方能通过增加肝糖原合成,降低血糖水平,减少糖毒;还能减少肝脏游离脂肪酸含量,减少肝脏脂质沉积,改善脂代谢紊乱,从而降低脂毒;尚能缓解肝脏氧化应激,从而1300 环球中医药2023年7月第16卷第7期 Global Traditional Chinese Medicine,July2023,Vol.16,No.7改善肝脏胰岛素抵抗并保护肝功能,其作用机制可能与调节ACC1/FASN/SCD1通路和GLUT2基因和蛋白表达有关㊂桑芪益气养阴方既能减少糖毒㊁又能降低脂毒,还能保护肝脏,体现了中医辨证论治,标本兼治的特点,为高糖高脂人群的疾病防治提供了方向㊂参考文献[1] SU Z Q,NIE Y T,HUANG X F,et al.Mitophagy in HepaticInsulin Resistance:Therapeutic Potential and Concerns[J].Frontiers in Pharmacology,2019,10:1193.[2] 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