慢病毒载体-是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统

慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。

主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。

慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。

最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。

慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。

（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。

4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。

慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

慢病毒载体的研究进展及应用张蕊;龚道清【摘要】慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用.作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】5页(P227-231)【关键词】慢病毒;慢病毒载体;基因治疗;转基因动物【作者】张蕊;龚道清【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,由于这类病毒的一个重要特点是病毒粒子中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶,故现名为逆转录病毒。

慢病毒已经从绵羊(绵羊脱髓鞘性脑白质炎/慢性进行性肺炎病毒)、山羊(羊关节炎脑炎病毒)、牛(牛免疫缺损病毒)、马(马传染性贫血病病毒)、猫(猫免疫缺损病毒)、猴(猴免疫缺陷病毒)和人(人免疫缺陷病毒)中分离得到(Robl等,2007)。

慢病毒在宿主细胞内,能以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA,再以此cDNA为模板合成双链DNA,经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达(李跃萍等,2006)。

慢病毒以其基因组为基础去除部分基因代之以所需的目的基因和标记物,构建而成的慢病毒载体(Lentiviral vector)具有转移效率高、可整合入宿主细胞基因组、包装后更安全并可转染非分裂期细胞等优点,在基因治疗和转基因动物生产中得以广泛的使用。

1 慢病毒载体1.1 慢病毒的基本结构慢病毒载体种类很多,其中对HIV-1的结构和生物学特征的研究较多,而HIV-1型已成为目前较为常用的慢病毒载体系统。

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。

基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。

近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。

关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。

其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。

理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。

由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。

1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。

慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。

病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。

目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。

慢病毒包装总结慢病毒的成分现在的慢病毒包装系统通常包括几个质粒，这几个质粒上分别含有慢病毒复制的成分，这样做的目的就是为了增加安全性，毕竟如果只用一个成分的话，危险系数很高，人一旦接触这种病毒就有可能遇到危险。

而把这几个成分分散在几个质粒中，很难在体外形成危险的病毒颗粒。

第二代慢病毒包装系统含有3个质粒，第3代慢病毒包装系统含有4个质粒。

这两代病毒包装系统都含有以下相同的成分：第一，编码目的蛋白或转录目的基因的转移质粒。

其实就是你自己的目的质粒，也就是通常需要自己做载体的质粒。

目的基因的两侧都含有长末端重复序列（LTR，long terminal repeat），LTR的作用就是辅助目的基因插入到宿主细胞的基因组。

许多慢病毒质粒都是基于HIV-1病毒改造的。

为了安全目的，这些目的质粒的复能能力并不完全，它们的3'LTR有所删减，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating）（SIN）。

第二，包装质粒，毒包装的结构蛋白编码质粒。

第三，包膜质粒，编码蛋白质外壳。

第二代慢病毒利用病毒的LTR启动子用于基因的表达，第三代慢病毒利用一个杂合的LTR启动子进行基因表达。

第二代慢病毒下图是第二代慢病毒系统：这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。

第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。

第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件的来激活它。

所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的LTR是Tat依赖性的。

第三代慢病毒第3代慢病毒如下所示：设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。

在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。

高滴度慢病毒的制备和纯化Production, Purification of Lentivirus forHigh-titer吴渊 潘建青 罗振 王立平摘 要 基于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体是一种广泛用于体外和动物实验的转基因载体。

慢病毒载体可以感染分化和非分化细胞，被感染的细胞长期稳定的表达转基因产物。

最近，慢病毒载体已经被广泛地应用于中枢神经系统的转基因研究。

本文将介绍一种新的慢病毒制备方法。

本方法制备和纯化的慢病毒可直接用于在活体中标记细胞特异性的神经元。

关键词 慢病毒；光感基因调控技术ABSTRACT　Lentivirus vector based on the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) is primarily a research tool to introduce a gene product into in vitro systems or animal models. The advantage of lentivirus vector is the ability for gene transfer and integration into dividing and non-dividing cells. Recently, the lentivirus system is used to transduce heterologous gene efficiently into central neural system. In this paper, we propose a novel protocol for lentivirus production. The highly purified and concentrated viruses can be used in cell-specific and in vivo neural labeling. KEYWORDS Lentivirus; Optogenetics1 引言慢病毒(lentivirus)为一类逆转录病毒的总称, 是基于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改建而来的载体系统，以其高效而稳定的特点被作为基因治疗动物实验的常用选择。

慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。

慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。

慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。

首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。

常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。

这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。

在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。

其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。

一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。

在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。

整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。

另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。

在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。

因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。

最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。

在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。

同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。

综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。

通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。

第二代和第三代慢病毒包装系统将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列进行分离.载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的HIV—1顺式作用序列。

同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

第一代包装系统中,除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV—G蛋白代替，应用VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,而且增加了载体的稳定性。

3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒.其中包装质粒在CMV 启动子的控制下，表达HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSV 2G）,应用VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度; 转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp 的gag 和RRE，并在其中插入目的基因或标志基因（绿色荧光蛋白GFP）。

在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性.第二代系统中5’LTR 634bp,3' LTR 634bp，5’LTR前不需要强启动子。

4质粒系统.第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造,换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3'LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入,如cPPT、WPRE。