5 离子交换色谱法

离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）2、离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。

阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。

由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱对于等电点⼩于5.0的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于7.0的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。

两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。

column chromatography（柱⾊谱）batch chromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。

d、亲和⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。

例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。

近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。

亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。

肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。

e、反相⾊谱常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。

如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。

同⼀个样品在同⼀Source 30 RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。

四、应⽤举例例⼀、⼀种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab⽚断（E.coli中表达）分⼦量：50 kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。

实验 5 离子色谱法测定水中阴离子一实验目的（1）掌握离子色谱法分析的基本原理。

（2）了解离子色谱仪的组成及基本操作技术。

（3）掌握常见阴离子的测定方法。

（4）掌握离子色谱的定性和定量分析方法。

二实验原理（1）进样：样品环进样（2）分离：离子交换分离离子色谱中使用的固定相是离子交换树脂。

离子交换树脂上分布有固定的带电荷的基团和能离解的离子。

当样品进入离子交换色谱柱后，用适当的溶液洗脱，样品离子即与树脂上能离解的离子连续进行可逆性交换，最后达到平衡。

不同阴离子（F-,Cl-，NO2-,NO3-等）与阴离子树脂之间亲和力不同，其在树脂上的保留时间不同，从而达到分离的目的。

（3）检测：电导检测器根据离子色谱峰的峰高和峰面积对样品中的阴离子进行定性和定量分析。

三仪器与试剂仪器：离子色谱仪；阴离子分析色谱柱：，阴离子分析色谱保护柱；超声波发生器；真空过滤装置；1mL、10mL 注射器各一支；0.20微米、0.45微米水相微孔过滤膜。

试剂：KCl、NaNO2均为优级纯；超纯水。

四实验步骤（1）准备浓度分别为 10ppm，20ppm，50ppm 和未知浓度的试样各一份。

(含KCl,NaNO2)（2）设置仪器参数：淋洗液流量0.8ml/min,数据采集时间10min.（3）用注射器注入10ppm 的溶液进入离子色谱仪并观察色谱图，一段时间后记下相关数据，依次进行其他浓度试样的检测。

(注意试液装入前清洗三次，最后抽取时无气泡）（4）绘制标准曲线。

五结果处理数据记录溶液离子出峰时间/min峰面积Cl-10ppmNO2-Cl-20ppmNO2-Cl-50ppmNO2-未知试样未知（1）根据标准试样和样品试样色谱图中色谱峰的保留时间，确定分析离子在色谱图中的位置答：（2）绘制标准曲线，拟合线性回归方程。

Cl-线性回归方程：NO2-线性回归方程：（3）计算水样中被测阴离子的含量。

答：六注意事项（1）淋洗液必须先进行超声脱气处理。

有机酸分离方法引言：有机酸是一类含有羧基（-COOH）的有机化合物，具有酸性。

有机酸的分离对于化学分析和工业生产具有重要意义。

本文将介绍几种常用的有机酸分离方法。

一、溶剂萃取法溶剂萃取法是一种常用的有机酸分离方法。

该方法利用不同有机酸在水和有机溶剂中的溶解度差异，通过萃取达到分离的目的。

一般来说，有机酸在有机溶剂中的溶解度较高，因此可以通过将混合溶液与有机溶剂进行摇匀、分层等操作，使有机酸从水相迁移到有机相中，从而实现分离。

二、离子交换色谱法离子交换色谱法是一种基于溶液中离子的吸附-解吸过程进行分离的方法。

该方法利用离子交换树脂的特性，通过控制溶液中的pH值和离子浓度，实现有机酸的分离。

离子交换色谱法具有分离效果好、操作简便等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。

三、薄层色谱法薄层色谱法是一种基于化合物在固体表面上吸附-解吸过程进行分离的方法。

该方法利用薄层色谱板上的吸附剂，通过控制溶剂的挥发速度和色谱板的温度，实现有机酸的分离。

薄层色谱法具有操作简便、分离效果好等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。

四、气相色谱法气相色谱法是一种基于化合物在气相中的分配系数进行分离的方法。

该方法利用气相色谱柱和气相载气的选择性，通过控制温度和流速等条件，实现有机酸的分离。

气相色谱法具有分离效果好、分析速度快等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。

五、液相色谱法液相色谱法是一种基于化合物在液相中的分配系数进行分离的方法。

该方法利用液相色谱柱和流动相的选择性，通过控制温度、流速和流动相组成等条件，实现有机酸的分离。

液相色谱法具有分离效果好、分析灵敏度高等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。

总结：有机酸分离是化学分析和工业生产中的重要步骤。

本文介绍了几种常用的有机酸分离方法，包括溶剂萃取法、离子交换色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法。

这些方法各具特点，可以根据实际需要选择合适的方法进行有机酸的分离。

在实际应用中，还可以结合多种方法进行分离，以提高分离效果和准确性。

多糖分离纯化一、概述多糖是一类高分子化合物，具有复杂的结构和多样的功能，广泛存在于生物体内。

多糖的分离纯化是研究其结构和性质、开发应用的前提和基础。

本文将介绍多糖分离纯化的方法及其优缺点。

二、多糖分离纯化方法1. 溶液沉淀法溶液沉淀法是一种常用的多糖分离纯化方法。

该方法基于不同多糖在不同浓度下溶解度不同的原理，通过控制溶液中某些成分（如盐类）浓度来使目标多糖沉淀。

该方法操作简单，但需要对目标多糖在不同条件下的溶解度有较为准确的了解，并且会受到其他成分影响。

2. 离子交换色谱法离子交换色谱法是一种利用固定在固相上带电基团与目标多糖间相互作用实现分离纯化的方法。

该方法适用于具有明显电荷差异或含有特定官能团（如硫酸基、羧基等）的多糖。

该方法分离效果好，但需要对固相的选择和操作条件进行优化。

3. 凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法是一种利用多孔凝胶作为分离介质，目标多糖根据其大小在凝胶中进行分离的方法。

该方法适用于具有不同分子量的多糖，且操作简单、分离效果较好。

但由于凝胶孔径大小限制，对于较小或较大的多糖可能无法有效分离。

4. 亲和层析法亲和层析法是一种利用目标多糖与特定配体间相互作用实现分离纯化的方法。

该方法适用于具有特定结构或功能的多糖，如具有特异性结合蛋白质、抗原表位等。

该方法操作简单、分离效果较好，但需要对配体选择和操作条件进行优化。

5. 聚焦电泳法聚焦电泳法是一种利用电场作用将目标多糖在pH梯度中移动并实现分离纯化的方法。

该方法适用于具有不同等电点或带电性质的多糖。

该方法分离效果好、可同时实现高效分离和纯化，但需要对pH梯度的选择和操作条件进行优化。

三、多糖分离纯化方法的优缺点1. 溶液沉淀法优点：操作简单，无需昂贵设备。

缺点：需要对目标多糖在不同条件下的溶解度有较为准确的了解，并且会受到其他成分影响。

2. 离子交换色谱法优点：分离效果好，适用于具有明显电荷差异或含有特定官能团（如硫酸基、羧基等）的多糖。

离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。

该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。

本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。

一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。

离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。

根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。

二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。

2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。

3、将样品溶液注入进样器中。

4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。

5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。

6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。

三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。

通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。

2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。

通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。

3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。

通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。

4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。

通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。

5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。

通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。

离子交换色谱法的分离原理和操作步骤离子交换色谱法（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的高效分离技术，广泛应用于药物研究、生物化学和环境监测等领域。

该技术的原理基于离子间的互相吸附和解吸作用，通过离子交换剂和淋洗缓冲液的选择实现目标物质的分离和纯化。

一、分离原理：离子交换色谱法的分离原理是基于离子交换剂与样品中离子的相互作用。

离子交换剂通常是具有固定电荷的树脂材料，其内部可以连接带正电（阴离子交换树脂）或带负电（阳离子交换树脂）的功能基团。

当样品中的离子进入色谱柱，会与离子交换剂表面的功能基团发生静电相互作用，发生互相吸附。

在离子交换色谱的过程中，树脂固定相上的离子交换剂与样品中的离子发生竞争吸附，较强的离子与树脂固定相发生更强的吸附，较弱的离子则发生较弱的吸附。

通过调整淋洗缓冲液的性质和浓度，可以改变离子交换剂与样品中离子的相互作用强度，实现对目标物的选择性吸附和解吸。

二、操作步骤：1. 样品预处理：将待检样品进行前处理，例如提取、浓缩和溶解等步骤，以获得适合分析的样品。

2. 样品加载：将样品通过进样口注入离子交换色谱柱中，尽量避免空气进入，以免影响分析结果。

3. 柱洗脱：通过在色谱柱上通入淋洗缓冲液，将非目标物质从固定相上洗脱。

淋洗缓冲液的性质和浓度需要根据目标物质的亲和性进行选择。

4. 目标物洗脱：通过改变淋洗缓冲液的性质和浓度，实现目标物质与固定相的离子交换。

通常，当淋洗缓冲液中的离子浓度增加时，目标物质与固定相之间的离子交换作用会减弱，从而实现目标物质的洗脱。

5. 柱平衡：在每次使用色谱柱之前，都需要进行柱平衡步骤。

通过使用柱平衡液将色谱柱进行适当的平衡，以确保每次实验结果的准确性和重现性。

6. 数据采集和分析：最后，用适当的检测器检测洗脱出的样品，并对数据进行采集和分析。

根据峰面积或峰高，可以定量分析目标物质的含量。

离子交换色谱法作为一种高效的分离技术，具有分析速度快、选择性高、分辨率好等优点。

方法摘要：离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。

当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。

溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脱时，组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。

紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。

范围：适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。

职责：操作人员：➢严格按照此规程要求进行操作。

岗位主管：➢起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；➢监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；➢培训，确保此操作规程的正确实施。

程序：1术语解释无2试剂和材料➢色谱柱：阳离子交换色谱柱，例如MabPac TM SCX-10，4.0×250mm，10µm（Thermo）➢试剂：N-（2-乙酰胺基）-2-氨基乙磺酸（ACES，分析纯），氯化钠（NaCl，色谱纯），盐酸（HCl，分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4，色谱纯），磷酸（H3PO4，色谱纯），纯化水（自制）➢滤膜：孔径为0.45µm或以下注：所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用；所有材料遵循厂家有效期。

3仪器设备➢液相色谱仪：例如Agilent 1260➢天平，精确到mg➢pH计➢溶剂过滤装置➢离心机（转速10000 rpm以上）➢移液器（10-1000 µl）4溶液配制4.1流动相配制4.1.1流动相A：20 mM ACES，pH 6.20称取ACES 3.64 g，加入1000 ml 水搅拌至完全溶解，HCl调pH 6.20±0.02；经0.45 μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。