收稿日期:2023-04-28作者简介:李闻洁(1995 ),女,浙江温州人,助理工程师,主要从事环境及食品检测,E-mail:619750020@㊂通信作者:王伟(1993 ),男,黑龙江双鸭山人,工程师,硕士,主要从事农产品㊁食品检测,E-mail:754727218@㊂文献著录格式:李闻洁,徐冰洁,朱晗昀,等.土壤中3种有机磷农药测定[J].浙江农业科学,2023,64(8):2028-2032.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20230449土壤中3种有机磷农药测定李闻洁,徐冰洁,朱晗昀,罗涛,王婷秀,桑力青,王伟∗(绿城农科检测技术有限公司,浙江杭州㊀310000)㊀㊀摘㊀要:本研究将土壤样品使用乙腈提取,配合QuEchERS 自动样品制备系统,采用多重反应监测模式(MRM),内标法定量,测定土壤中有机磷农药浓度㊂结果显示,灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷在质量浓度为0.01~0.50mg㊃L-1范围内线性关系良好,定量限为0.002mg㊃kg -1㊂当添加浓度为0.004㊁0.01和0.040mg㊃kg-1时,灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷回收率范围为82.87%~92.49%,相对标准偏差范围为3.38%~9.56%㊂本方法提取环节自动化㊁操作便利㊁抗干扰能力强,可满足日常批量检测,适用于土壤中灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷三种有机磷农药残留量的同时检测㊂关键词:土壤;有机磷;气相色谱-串联质谱法;QuEchERS 自动样品制备系统中图分类号:S153㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2023)08-2028-05㊀㊀有机磷农药(organophosphorus pesticides,OPPs),是一类硫代羟基衍生物或有机酯类化合物,可有效降低胆碱酯酶活性,并具备广谱㊁价格低廉等优点,被广泛应用于农田中害虫防治[1-6]㊂我国作为农业大国,OPPs 的单位面积使用量远高于世界平均水平[7],但农药的利用率仅约35%[8],多数药物残留在大气及土壤中㊂残留在土壤中的OPPs,伴随着大气降水或灌溉水下渗,使地下水受到影响;或通过其他媒介进入食物链,引发急慢性农药中毒事件,严重危害人类健康[9-11],据调查,每年有约300万人因为OPPs 的残留问题而引发中毒,其中更有20万人因此死亡[12]㊂土壤中残留的OPPs 还会改变土壤微生物群落结构,抗药菌群成为优势种群,轻则会减少微生物的种类,严重则会导致敏感菌群灭绝,破坏土壤中生物多样性㊂为保障农产品质量安全㊁人畜安全和生态环境安全,我国陆续发布了相关法令对OPPs 作出禁用㊁限用要求,如近期发布的‘中华人民共和国农业农村部公告“(第536号)中指出,自2024年9月1日起,禁止销售和使用甲基异柳磷等4种有机磷农药㊂目前,OPPs 常用的前处理技术有QuEChERS㊁固相萃取法(SPE)㊁凝胶渗透色谱(GPC)㊁加速溶剂萃取(ASE)等[13-16];常用的仪器多为气相色谱仪㊁气相色谱-质谱联用仪㊁液相色谱仪㊁液相色谱-质谱联用仪等[17-26],检测基质多为果蔬㊁茶叶㊁稻谷等㊂土壤作为农药残留物的重要载体,对其进行农药残留量的检测则十分必要㊂我国针对土壤中农药残留量的检测发布了诸多相关检测标准,例如HJ 835 2017㊁HJ 960 2018㊁HJ 961 2018㊁HJ 1022 2019㊁HJ 1023 2019等,这些标准中多采用气相色谱法㊁液相色谱法等,气相色谱-串联质谱法相对较少,仅‘土壤和沉积物有机磷类和拟除虫菊酯类等47种农药的测定气相色谱-质谱法“(HJ1023 2019)采用气相色谱-串联质谱法测定土壤中OPPs 残留量,但该标准中前处理过程复杂,扫描模式为选择离子定量模式(SIM),抗干扰能力低于多重反应监测模式(MRM)㊂开发操作简单㊁抗干扰能力强的气相色谱-串联质谱法检测土壤中OPPs 残留量,对于土壤中OPPs 的监测具有重要意义㊂本研究使用QuEchERS 自动样品制备系统配合气相色谱-串联质谱技术(GC-MS /MS)建立了同时测定土壤中水胺硫磷㊁灭线磷和甲基异柳磷3种农药残留的检测方法,以期为土壤中3种有机磷残留量的同时检测提供技术支持㊂1㊀材料与方法1.1㊀仪器材料仪器:岛津TQ8040NX 气相色谱三重四级杆质谱仪;QuEchERS自动样品制备系统(北京本立科技有限公司);ST16R型高速离心机(美国Thermo Fisher公司);BSA2202S型电子天平(德国Sartorius公司);Troemner涡旋振荡仪(美国Henry Troemner公司);全自动氮吹浓缩仪(杭州博睿科仪器有限公司);KQ5200E超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);0.22μm有机膜㊂1.2㊀试剂㊀㊀乙腈㊁正己烷㊁丙酮㊁二氯甲烷(色谱纯,美国Baker公司);氯化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);实验室用水为一级水;灭线磷(CAS:13194-48-4)㊁甲基异柳磷(CAS:99675-03-3)㊁水胺硫磷(CAS:24353-61-5)(100μg㊃mL-1,1mL,天津阿尔塔科技有限公司)㊂提取剂: 6.4g无水硫酸镁㊁1.6g氯化钠㊁1.6g柠檬酸三钠㊁0.8g柠檬酸氢二钠㊂净化剂:0.1g PSA㊁0.1g C18㊁0.3g MgSO4㊂1.3㊀标准溶液配制㊀㊀准确量取浓度为100μg㊃mL-1的灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷液态标样各1.0mL,至于刻度为10mL的棕色容量瓶中,使用丙酮定容至刻度,此溶液即为浓度10μg㊃mL-1的标准储备液㊂该标准储备液于-18ħ避光保存,有效期1a㊂1.4㊀前处理方法1.4.1㊀样品制备㊀㊀采集具有代表性土壤样品约500g,挑出杂质及石块,进行冷冻干燥㊁研磨处理,并过0.85mm 筛,将筛后土壤装入密封袋,于4ħ冷藏保存㊂1.4.2㊀前处理过程㊀㊀准确称取10.00g筛后土壤样品于本立专用配备的80mL塑料外管中,准确加入10mL一级水, 20mL乙腈,10.4g提取剂,加入24颗均质子(本立专用),放入内管(内含0.5g净化剂),内管滤膜方向朝外,放于QuEchERS自动样品制备系统中㊂自动制备结束后,从内管中取2mL上清液置于10mL刻度管中,在40ħ水浴中氮吹至近干,用正己烷定容至2mL,加入50μL外环氧七氯,超声1min,涡旋30s,过0.22μm有机相滤膜,待上机测定㊂1.5㊀仪器工作条件㊀㊀QuEchERS自动样品制备系统参数:第1步: 1000r㊃min-1,振荡300s;第2步:4200r㊃min-1,离心300s;第3步:1000r㊃min-1,振荡300s;第4步:4200r㊃min-1,离心300s㊂色谱条件㊂色谱柱选择DB-5ms毛细管柱(规格:20mˑ0.25mmˑ0.25μm);样品进样量设置为1μL;进样口温度设置为250ħ;载气为氦气㊂升温程序:初始温度设置为80ħ,保持0min;以40ħ㊃min-1的升温速率升至250ħ,保持0min;以20ħ㊃min-1的升温速率升至290ħ,保持3.75 min㊂柱流量设置为2.12mL㊃min-1,进样方式为不分流进样㊂质谱条件㊂离子源选择电子轰击源(EI源),离子源温度设置为230ħ,接口温度设置为290ħ,溶剂延迟时间设置为1.00min,扫描模式为多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)㊂灭线磷(CAS:13194-48-4)保留时间为3.263min,定量离子对为200.0>158.0(6eV),定性离子对为200.0>97.0(24eV);水胺硫磷(24353-61-5)保留时间为4.286min,定量离子对为135.9>108.0 (15eV),定性离子对为135.9>69.0(30eV);甲基异柳磷(99675-03-3)保留时间为4.353min,定量离子对为199.00>121.1(10eV),定性离子对为241.1>199.1(10eV)㊂2㊀结果与分析2.1㊀提取溶剂选择㊀㊀为验证不同试剂对目标化合物的提取效果,本试验比较了乙腈㊁二氯甲烷-丙酮㊁丙酮和正己烷4种提取试剂㊂由表1可知,乙腈和正己烷作为提取试剂时,目标化合物回收率相对稳定且满足农药残留回收率70%~120%的质控范围㊂乙腈作为提取试剂时,3种化合物的提取率更为接近,且乙腈作为一种常见的农药残留提取试剂,具有价格低廉㊁可溶解多数有机物㊁自身性质稳定,不易损失等优点,并在提取过程中因有氯化钠的存在,可便于有机相和水相分层㊂综上所述,本试验选用乙腈为提取试剂㊂表1㊀不同提取试剂下3种化合物回收率参数不同提取试剂的回收率/%二氯甲烷ʒ丙酮(1ʒ1)丙酮正己烷乙腈灭线磷123110103.079.1水胺硫磷16218383.281.7甲基异柳磷117142107.088.6 2.2㊀提取方式选择㊀㊀目前,土壤中有机磷的提取方式常采用振荡法或超声法,但是二者均存在耗时长㊁试剂消耗量大等弊端㊂近年来,QuEchERS法已经逐步应用于土壤中农药残留量的检测,该方法操作简便㊁试剂消耗量低㊁数据稳定㊂本实验基于QuEchERS前处理原理,配合QuEchERS自动样品制备系统,与振荡法和超声法进行比较,了解3种方法下目标化合物的提取效果㊂结果表明,使用振荡法提取时,灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷平均回收率分别为72.6%㊁106%和92%;使用超声法提取时,三者回收率分别为66.8%㊁91.8%和88.2%;使用QuEchERS法QuEchERS自动样品制备系统时,三者回收率分别为79.1%㊁81.7%和88.6%㊂由此可见,超声法提取时,灭线磷回收率相对较差,振荡法和QuEchERS法3种有机磷农药的回收率均满足70%~120%的范围,但是QuEchERS法对于同时提取灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷效果更加稳定,且振荡提取过程中,需先将土样浸泡6~8h,振荡1h,时间耗费过长㊂综上所述,QuEchERS法配合自动样品制备系统提取具有操作简便㊁重复性良好等优点,全程自动化,节约人工成本㊂故本试验选取QuEchERS自动样品制备系统提取土壤中的目标化合物㊂2.3㊀质谱条件优化㊀㊀质谱条件优化时,先采用全扫描模式(Q3 Scan)对灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷进行质谱分析,以便确定3种目标化合物的保留时间,并在质谱图中确定前体离子(质荷比以及绝对强度较大的离子)㊂以3eV为一个碰撞能量间隔,扫描范围为3~45eV,对确定的前体离子进行产物离子扫描,以此确定定量离子(强度最大)和定性离子(强度次之)㊂图1~3为灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷在MRM模式下的色谱图㊂图1㊀MRM模式下灭线磷色谱2.4㊀基质效应验证㊀㊀土壤样品性质较为复杂,基质干扰对数据的准图2㊀MRM模式下水胺硫磷色谱图3㊀MRM模式下甲基异柳磷色谱确性影响较大㊂为验证土壤基质的干扰程度,本方法分别使用溶剂和基质配制标准曲线,线性浓度包括0㊁0.01㊁0.05㊁0.1㊁0.2㊁0.5mg㊃kg-1㊂灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷的标准曲线方程及相关系数见表2,3种目标化合物的相关系数均可达0.999以上,线性关系良好㊂基质效应验证按以下公式进行计算:基质效应=(S m/S s-1)ˑ100%㊂式中S m为基质标准曲线斜率,S s为溶剂标准曲线斜率㊂基质效应小于20%为弱基质效应;20%~ 50%为中等基质效应;大于50%为强基质效应[27]㊂计算可得,灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷分别呈现出弱㊁中㊁弱基质效应㊂3种目标化合物中,两种为弱基质效应,一种为中等基质效应,可使用溶剂标准曲线定量㊂2.5㊀定量限的确定㊀㊀在最优试验条件下,设置不同添加浓度进样(添加浓度分别为0㊁0.002㊁0.01㊁0.02㊁0.04和0.1mg㊃kg-1),对土壤中3种有机磷农药测定的方法进行定量限的确定㊂方法定量限的定义为满足回收率>60%,且相对标准偏差(RSD)<20%的最低添加浓度㊂结果表明,灭线磷㊁水胺硫磷和甲㊀㊀表2㊀灭线磷、水胺硫磷和甲基异柳磷的标准曲线方程及相关系数参数线性方程(溶剂)相关系数R2(溶剂)线性方程(基质)相关系数R2(基质)灭线磷Y=12.427815X0.999397Y=12.329387X0.999714水胺硫磷Y=13.045189X0.999012Y=17.194164X0.999393甲基异柳磷Y=40.740494X0.999965Y=38.155897X0.999911基异柳磷的最低添加浓度为0.002mg㊃kg-1时,回收率分别为83.5%㊁80.2%和90.7%㊁RSD分别为7.35%㊁10.12%和11.33%㊂综上所述,本方法的3种有机磷的定量限定义为0.002mg㊃kg-1㊂2.6㊀准确度和精密度准确称取10.00g土壤样品,分别加入一定量的浓度为10μg㊃mL-1的标准储备混合液(1.3节),制成浓度分别为0.004㊁0.010和0.040mg㊃kg-1的加标样品,按照本方法的前处理方法处理后,设置6个平行试样,计算不同浓度下3种化合物的平均加标回收率和相对标准偏差,结果见表3㊂表3㊀不同浓度下3种化合物回收率情况添加浓度/ (mg㊃kg-1)回收率/%相对标准偏差/%灭线磷水胺硫磷甲基异柳磷灭线磷水胺硫磷甲基异柳磷0.00489.4490.3492.49 3.389.56 6.85 0.01089.3482.8784.83 5.45 5.27 5.50 0.04086.2083.1888.51 5.46 5.18 4.492.7㊀实际样品检测㊀㊀选择现有的不同类型土壤样品(30个)进行检测,并随机对其中5个土壤样品进行加标试验㊂依据本文建立的方法,对实际检测效果以及回收率情况进行考察㊂结果表明,所有土壤样品中均未检出灭线磷㊁水胺硫磷和甲基异柳磷,加标样品回收率范围为79.32%~90.51%㊂3㊀结论㊀㊀本方法使用QuEchERS自动样品制备系统前处理方式配合气相色谱-串联质谱技术(GC-MS/MS)建立了同时测定土壤中灭线磷㊁水胺硫磷㊁甲基异柳磷3种农药残留的检测方法,与以往测定土壤中有机磷的方法相比,本方法具有定性效果好㊁线性范围广㊁检出限低和精密度高等优点,可实际应用于土壤中水胺硫磷㊁灭线磷和甲基异柳磷3种农药同时检测㊂参考文献:[1]㊀ZHU C Y,ZHU F X,WANG F W,et parison ofpersulfate activation and Fenton reaction in remediating anorganophosphorus pesticides-polluted soil[J].Pedosphere,2017,27(3):465-474.[2]㊀WANG J W,TENG Y G,ZHANG C X,et al.Activation ofmanganese dioxide with bisulfite for enhanced abioticdegradation of typical organophosphorus pesticides:Kinetics andtransformation pathway[J].Chemosphere,2019,226:858-864.[3]㊀AGGAG S,MOUNIR S,YACOUT M M,et al.Organophosphorus pesticides biodegradation by three bacterialGenera and their protoplast fusants[J].Journal of AppliedBiological Sciences,2021,11:29-32.[4]㊀QIN Y,WU Y,CHEN G J,et al.Dissociable photoelectrodematerials boost ultrasensitive photoelectrochemical detection oforganophosphorus pesticides[J].Analytica Chimica Acta,2020,1130:100-106.[5]㊀CHU Y H,LI Y,WANG Y T,et al.Investigation ofinteraction modes involved in alkaline phosphatase andorganophosphorus pesticides via molecular simulations[J].Food Chemistry,2018,254:80-86.[6]㊀ROVINA K,VONNIE J M,MANTIHAL S,et al.Developmentof films based on tapioca starch/gold nanoparticles for thedetection of organophosphorus pesticides[J].Journal ofConsumer Protection and Food Safety,2021,16(2):143-152.[7]㊀王志刚,费荣杰.有机磷农药检测方法研究及进展[J].化学试剂,2023,45(3):141-147.[8]㊀吴子彦,邱钦云,王彦沣,等.有机磷农药在农田中的残留降解及其土壤生态毒理学研究[J].广州化工,2021,49(23):28-30.[9]㊀PUNDIR C S,MALIK A.Bio-sensing of organophosphoruspesticides:a review[J].Biosensors and Bioelectronics,2019,140:111348.[10]㊀XIE M J,ZHAO F G,ZHANG Y P,et al.Recent advances inaptamer-based optical and electrochemical biosensors fordetection of pesticides and veterinary drugs[J].Food Control,2022,131:108399.[11]㊀APARICIO V C,de GERÓNIMO E,MARINO D,et al.Environmental fate of glyphosate and aminomethylphosphonicacid in surface waters and soil of agricultural basins[J].Chemosphere,2013,93(9):1866-1873.[12]㊀SOGORB M A,VILANOVA E,CARRERA V.Futureapplications of phosphotriesterases in the prophylaxis andtreatment of organophosporus insecticide and nerve agentpoisonings[J].Toxicology Letters,2004,151(1):219-233.[13]㊀王连珠,周昱,陈泳,等.QuEChERS样品前处理-液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中66种有机磷农药残留量方法评估[J].色谱,2012,30(2):146-153.[14]㊀肖海军,张偎,陈孝权,等.分散固相萃取-气质联用法同时检测茶叶中32种农药多残留[J].西南师范大学学报(自然科学版),2015,40(12):27-32.[15]㊀闫蕊,邵明媛,鞠福龙,等.加速溶剂萃取-高效液相色谱串联质谱法测定土壤中农药残留[J].分析化学,2013,41(2):315-316.[16]㊀张焱屾,汪金生,贾乃峰,等.农药残留检测的前处理技术[J].现代农业科技,2011(2):27-28.[17]㊀何佩雯,赵海誉,杜钢,等.气相色谱技术在中药农药残留检测中的应用[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(2):126-134.[18]㊀赵建伟,岳永德,汤锋,等.气相色谱法测定蔬菜㊁水果中多种有机磷农药残留[J].安徽农业大学学报,2010,37(1):82-87.[19]㊀罗庆,孙丽娜.超声波提取-GC/MS法同时测定农用土壤中有机氯农药和多氯联苯[J].安徽农业科学,2010,38(22):12195-12197,12245.[20]㊀赵丽,农蕊瑜,师真,等.分散固相萃取-气相色谱-质谱联用测定茶叶中的28种农药残留[J].江苏农业科学,2020,48(12):208-215.[21]㊀马世柱,陈楠,黎小鹏,等.高效液相色谱法测定鸡蛋中磺胺类药物残留[J].现代农业科技,2018(11):235-236,239.[22]㊀姜欣.4种常用有机磷农药反相高效液相色谱分析[J].农药,2009,48(4):272-273.[23]㊀LAZARTIGUES A,WIEST L,BAUDOT R,et al.Multiresiduemethod to quantify pesticides in fish muscle by QuEChERS-based extraction and LC-MS/MS[J].Analytical andBioanalytical Chemistry,2011,400(7):2185-2193. [24]㊀ISSA M M,M TAHA S,EL-MARSAFY A M,et al.Acetonitrile-Ethyl acetate based method for the residue analysisof373pesticides in beeswax using LC-MS/MS and GC-MS/MS[J].Journal of Chromatography B,Analytical Technologies inthe Biomedical and Life Sciences,2020,1145:122106. [25]㊀何倩.QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜中64种农药残留[J].安徽农业科学,2021,49(22):200-204.[26]㊀王静,刘铮铮,钟光剑.超高效液相色谱-串联质谱法分析土壤及沉积物中氨基甲酸酯农药[J].中国环境监测,2013,29(4):103-106.[27]㊀贺泽英,张艳伟,王雯雯,等.QuEChERS-气相色谱三重四极杆串联质谱法测定土壤中227种农药残留[J].环境化学,2020,39(7):2022-2025.(责任编辑:汪亚芳)。
