仪器分析高效液相色谱法PPT课件

❖ 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理 论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、 操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱 法优越性，现从两方面进行比较：
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。
❖ 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测器 的有示差折光，电导检测器等。
第三节 固定相和流动相
（－）固定相
❖ 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。
❖ 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～ 1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的 颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合 固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种 固定相。
1、高压输液系统
❖ 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力 很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。
❖ 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。
❖ 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
❖ 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔 型和全多孔型固定相两类。
1.表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔 活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、 聚酸胺等。
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动 相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不 稳，或产生“伪峰”。

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高效液相色谱法与经典液相色谱法：
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大 优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高
速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效 液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达
103cm·min-1。
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• 选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强 的流动相，极性小的则用低极性流动相。
• 为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多 种不同极性的溶剂混合起来使用，如果试样组分的分 配比值范围很广，则采用梯度洗脱。
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16-3-4 应用
液固色谱最适宜分离那些溶解在非极性溶剂中、具有中 等相对分子质量且为非离子型的试样。 特别适用于分离异构体。
• 极性吸附剂又分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包 括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺 等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附 剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧酸和吡咯衍生物。
• 最常用的是硅胶，其次是氧化铝。很多薄层色谱和经典色谱 是用硅胶进行分离的。现代液相色谱中硅胶不仅作为液固吸 附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱 填料的基体。表16-2。
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外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀，将两种或多种不 同极性的溶剂按一定的比 例抽入高压泵中混合。
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梯度洗脱的实质是通过不断的变化流动相的强度，来
调整混合试样中各组分的k’值，使所有谱带都以最佳 平均k’值通过色谱柱。它在液相色谱分离中所起的作 用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在 梯度洗脱中溶质k’值的变化是通过改变溶剂的极性、

色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
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▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
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色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
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什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
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– 分离机理：组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面 活性中心
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱

chromatography）。
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手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
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离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
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喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述

• 间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量 因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆 满的选择性分离。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。

选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/7/7
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影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离 因子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
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二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
sm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
dp 2 Cm Csm Dm
dp 2 C
Dm
T Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效 T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3. 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
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与GC相比，流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用