高效液相色谱法讲解精选课件PPT

第一节 高效液相色谱法的主要类型及其固定相和流动相
一、高效液相色谱法的主要类型
1、按固定相聚集状态分为：液液色谱法（LLC）和液 固色谱法(LSC)。
2、按分离机制分为：分配色谱法、吸附色谱法、离子 交换色谱法、分子排阻色谱法。
此外，按分离机制不同，还有亲和色谱法、手性色谱 法、胶束色谱法、电色谱法及生物色谱法等。
（2）弱极性键合相：。常见的有醚基和二羟基键合 相。通常用于反相色谱或正相色谱固定相。
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（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别 将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用 作正相色谱固定相。
氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好 的分离能力。
氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性 介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分 离带羰基的物质
的20色21/3谱/2 特性。
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（二）其它种类的固定相
1、键合型离子交换剂： 以硅胶为载体的键合型离子交换剂是在全多孔(或 薄壳型)硅胶表面，用化学方法键合上各种离子交换基团。
2、手性固定相： 在硅胶表面上用化学方法键合上各种手性基团。
3、亲和色谱固定相：
由载体和健合在其上的配基组成。载体通常为全多孔 硅胶，配基可分为生物配基和基团配基。
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2、键合相的特点
（1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长; （2）均一性和重现性好;
（3）柱效高,分离选择性好;
（4）适于梯度洗脱;
（5）载样量大.
3、使用注意事项：（1）源自用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化 硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）；
（2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同
水 甲醇 乙腈 丙酮 二噁烷 乙醇 异丙醇 四氢呋喃
0 3.0 3.2 3.4 3.5 3.6 4.2 4.5
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2、混合溶剂的强度
正相色谱法的多元混合溶剂的强度极性参数： n
P混’ = ∑Pi’φi i=1
反相色谱法的多元混合溶剂的强度强度因子： n
S混 = ∑Si’φi i=1
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三、高效液相色谱法的流动相
对流动相的基本要求：
①化学稳定性好；②对试样有适宜的溶解度，使k 在1-10范围内。③必须与检测器相适应；④纯度高， 粘度低。
（一）流动相对分离的影响
r==(√n /4).[(α-1)/α][k2/(1+k2)]
α受溶剂种类影响，k受溶剂配比的影响。改变溶剂 及配比，能够改变分离能力。增加流动相中强溶剂的比例， 其洗脱能力增强，使k变小。
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3、溶剂的选择
斯奈德以溶剂和溶质间的作用力作为溶剂选择性分类 的依据，将常用溶剂分为八组，并得到溶剂选择性分类三 角形，如下图：
处于同一组中的 各溶剂的作用力类型 相同，在色谱分离中 具有相似的选择性， 处于不同组别的溶剂， 其选择性差别较大。 采用不同组别的溶剂 为流动相，能够改变 色谱分离的选择性。
液液分配色谱：固定相是涂在细颗粒载体表面的液体。
液固吸附色谱：固定相主要是全多孔型硅胶和高分子 多孔微球。
液相色谱中应用最多的固定相是化学键合相。
化学键合相是通过化学反应将有机基团键合在载体表 面构成固定相，简称键合相。以键合相为固定相的色谱法。 称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。
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第十八章高效液相色谱法
以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱法。高效 液相色谱法是以高压液体为流动相，采用高效固定相及高灵 敏度检测器的液相色谱法。
与经典液相色谱相比优点：
1、分离效率高；
2、分析速度快；
3、灵敏度高。
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与气相色谱比优点： 1、应用范围广； 2、分离选择性高； 3、在室温条件下进行分离1 。
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四、正相化学键合色谱法
正相键合相色谱法采用极性键合相为固定相，如氨 基、氰基等。以非极性或弱极性溶剂，如烷烃加适量极 性调整剂如醇类作流动相。
正相键合相色谱法主要用于分离溶于有机溶剂的极 性至中等极性的分子型化合物。
正相键合相色谱法的分离选择性决定于键合相的种 类、流动相的强度和试样的性质。一般规律是：极性强 的组分保留因子k大，后洗出柱。流动相的极性增强，洗 脱能力增加。
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（一）常用化学键合相的种类和性质
1、常用化学键合相的种类
常用于反相和正相色谱中的化学键合相按所键合基 团的极性可分为非极性、弱极性和极性三类：
（1）非极性键合相：键合相表面基团为非极性烃基。 通常用作反相色谱固定相。
十八烷基硅烷键合相是最常用的，是由十八烷基 硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基经多步反应生成的键合 相。
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在正相色谱中，常用溶剂的极性参数(P’) (P’越大，溶剂洗脱能力越强)
苯 乙醚 二氯甲烷 正丙醇 四氢夫喃 三氯甲烷
2.7 2.8
3.1
4.0
4.0
4.1
乙醇 醋酸乙酯 丙酮 甲醇 乙腈 醋酸 水
4.3
4.4 5.1 5.1 5.8 6.0 10.2
反相色谱常用溶剂的强度因子（S） (S越大，溶剂洗脱能力越强)
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（二）溶剂的强度和选择性
1、溶剂的极性和强度 在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力即溶剂 强度直接与它的极性有关。
在正相色谱中，溶剂的极性越强，洗脱能力越强，即 极性强的溶剂是强溶剂。
在反相色谱中，溶剂的极性越弱，洗脱能力越强，即极 性弱的溶剂洗脱能力，是强溶剂。
根据斯奈德提出的溶剂极性参数，在分配色谱中，溶剂 的极性强弱顺序如下表：。
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五、反相化学键合相色谱法
反相键合相色谱法采用非极性键合相为固定相，如 十八烷基硅烷、辛基等化学键合相。流动相以水作为基 础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂，常用甲醇水、乙腈-水等
反相键合相色谱法适和分离非极性至中等极性的组 分。
目前高效液相色谱法中最常用的固定相是化学键合相，
故这些方法又称为化学键合相色谱法。本章主要介绍化学键
合相色谱法及由其衍变和发展的离子抑制色谱法和离子对色
谱法。
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二、高效液相色谱法的固定相
高效液相色谱法对固定相的要求：1、颗粒细则均匀； 2、传质快；3、机械强度高，能耐高压；4、化学稳定性 高好，不与流动相发生化学反应。