高效液相色谱法PPT课件

第四章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
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本章要求
⒈ 了解高效液相色谱法的优缺点 ⒉ 了解高效液相色谱仪的结构 ⒊ 掌握常用检测器的原理及应用范围
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4.1 高效液相色谱法简介
一、 概述
定义：以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法 高效液相色谱法（HPLC）：20世纪60年代末70年代 技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器 特点：速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化
⑶ 高灵敏度：现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器， 使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测 限可达10-9 g；荧光检测器最小检测限可达10-11~10-13 g。
⑷ 高自动化：HPLC进样量小(X~X0 L)。带有自动进样装置 和工作站。
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2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
⑴ 适用范围
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3. 分离系统--色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固 定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及 内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限， 故金属管用得较多。一般色谱柱长15~30 cm，内径 为4~5 mm，凝胶色谱柱内径3~12 mm，制备柱内径 较大，可达25 mm 以上。
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4.2 高效液相色谱仪
一﹑高效液相色谱仪的结构
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一般分为4个主要部分：高压输液系统、进样系统、分 离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度洗 脱、自动进样及数据处理等。
工作过程如下：
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入 色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样 品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱 柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检 测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。
离，要求达到1.5~3.0×107 Pa的压力或更高。 ④ ④ 泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。
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常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种: ㈠ 恒流泵 是在一定操作条件下，输出流量恒定，与
色谱柱引起阻力变化无关。 ㈡ 恒压泵 能保持输出压力恒定，其流量随色谱系统
阻力而变化，保留时间的重现性差。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵，恒流泵又称机械
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梯度洗脱的优点：
① 改善峰形； ② 提高柱效； ③ 减少分析时间； ④ 使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持良好的柱性能
（但进行下次分析时，更换流动相达到平衡时间长）。
梯度洗脱与气相色谱的程序升温十分类似，两者的目的相 同，不同的是程序升温是通过改变柱温，而液相色谱的梯 度洗脱是通过改变流动相的组成、极性、pH来达到改变k 的目的。
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⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N=104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N=103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
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HPLC的系统组成
输液系统
进样系统
分离系统
数据分析 系统
检测系统
数据处理系统
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1. 高压输液系统：
一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组 成，其中高压输液泵是核心部件。
高压泵应满足如下要求： ① 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。 ②Fra Baidu bibliotek能抗溶剂的腐蚀，耐酸、耐碱。 ③ 有较高的输送压力。一般分离，6.0×104 Pa压力；高效分
泵，又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多 的是机械往复泵。
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梯度洗脱装置
在液相色谱中，改变流动相可以改善分离效果。因 此在分离复杂混合物时，按照一定的程序连续改变 流动相的组成，可提高分离效率和加快分析速度。 梯度洗脱装置就是为此目的而设置的一种装置。
梯度洗脱装置有两类： 低压梯度：常压下预先按一定的程序将溶剂混合后
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⑴ 固定相 ① 表面多孔固定相
1~2 m 直径10~25 m
② 全多孔微粒固定相
直径2~10 m，孔径2~100 nm， 比表面积x00 ~ x0m2/g。 现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶
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③ 化学键合固定相 化学键合相色谱柱 虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或
全多孔硅胶上作固定相，但有许多缺点，因此现在多 采用化学键合固定相。化学键合固定相是在表面多孔 或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有 机分子结合在载体表面。 键合类型： ㈠ 疏水基团：如C8、C18； ㈡ 极性基团：如丙氨基(-C3H6NH2)、氰乙基(-C2H4CN)；
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2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
再用泵输出色谱柱； 高压梯度：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统梯
度混合室，加以混合后送入色谱柱。
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在分离过程中，使流动相的组成、极性、pH等 按一定程序连续变化，使样品中各组分能在最 佳条件下出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重 叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获 得很好的分离。
通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力，梯 度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比 例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。
GC适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物， HPLC不受此种限制。气相色谱一般都在较高温度下进行， 而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
⑵ 流动相
GC流动相仅运载样品，不起分离作用，但无毒，易于 处理。而HPLC流动相除了运载样品外，还有分离作用，可 改变流动相组成，进行有效的分离。但流动相一般有毒，费 用高。
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1．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较
⑴ 高速：HPLC分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟 就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。
⑵ 高效：HPLC高压(2~6 MPa)下操作，填料颗粒小(2~50 m)， 规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高(N=4000~60000 块/m)，分离效率高。