pET载体原核表达鉴定与条件优化

表达载体pETA.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。

目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。

T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。

尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。

降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。

该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。

用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。

如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和pI 启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。

在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。

尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。

两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。

所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。

pET 表达系统包括质粒和宿主菌。

您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。

B.使用许可及协议Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。

详情请垂询。

C. 系统组成pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。

抗生素抗性
pET载体常用的两种筛选标记是Ampr+和Knar+ 因为内酰胺酶的消化和PH的降低，Ampr+的选择 性易于丢失。某种情况下使用Knar+更为有利。 Ampr+和Knar+的另一个不同是两种基因的转录 方向不同 。Ampr+位于T7启动子下游，与其方向 相同。除了pET5系列，T7转录终止序列位于内酰 胺酶基因前面，但是这个终止序列只有70%的有 效性。因此，T7聚合酶能够通读，导致内酰胺酶 的积累。相反Knar+的转录方向与T7启动子方向 相反，诱导时并没有Knar+基因的增加。
lacUV5 Promoter
与野生型lac启动子相比，控制T7RNA聚合 酶表达的 lacUV5启动子对 cAMP/CRP的刺 激并不敏感。然而，最近研究发现rDE3宿 主菌在缺少葡萄糖的培养基生长到稳定期 时，cAMP同样对lacUV5产生了去阻遏作用。 尽管宿主菌长到稳定期并不推荐，菌体培 养过夜（16h）后转入含有1%的葡萄糖的 培养基中，可以有效避免去阻遏作用，因 为glucose可以cAMP的产生。
BL21(DE3)
BL21(DE3)是应用最广泛的表达宿主菌。是 lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶（纯化过程可 以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更 加稳定。 因为BL21(DE3)对利福平敏感，如果有必要 可以用利福平来限制宿主RNA和蛋白质的 背景合成。
应该注意一些7启动子 而没有额外的lac阻遏子基因的载体并不适 合。这些载体上的多拷贝lac操纵 子（用于 蓝白斑筛选）会结合lac抑制因子，使pet菌 株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表 达。。结果基本的T7RNA聚合酶活性升高， 使目的基因的稳定性受到影响。

pET原核表达金标准（转）pET, 原核, 表达转自网络pET，原核表达金标准（转）pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。

Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点•是原核蛋白表达引用最多的系统•在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低•真正的调节表达水平的“变阻器”控制•提供各种不同融合标签和表达系统配置•可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌•许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物•许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET 系统概述pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。

根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。

没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。

在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。

未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。

而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。

pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。

pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。

【专题讨论】原核表达条件优化！会不会是蛋白质的表达量低，电泳并不能反映出来，典型的例子是干扰素，虽然电泳没有新生条带，但是裂解上清的活性却很高。

“疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白，42度发酵，可抑制宿主菌蛋白表达疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白?那条带也挂在亲合柱子上的，发酵的细菌蛋白却没有。

挂在亲合柱子上,也有可能是非特异性条带，如用HIS TAG亲合柱，加大米错量试一下。

胞内表达有生物活性蛋白的一些策略包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。

有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（14）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。

胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。

这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如DsbA/DsbB难以正确折叠。

有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的TrxB基因失活以及造成一定的还原势。

硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。

这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。

Novagen公司pET宿主菌系列中的AD494（DE3）和Origami B(DE3)都是TrxB基因突变菌株。

丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化作者：张利华,吴文燕,黄璐琦,申业来源：《中国中药杂志》2012年第24期[摘要] 目的：在前期克隆丹参SmJAZ1基因的cDNA全长基础上，为研究丹参SmJAZ蛋白的功能，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达丹参SmJAZ1蛋白，并对其表达条件进行优化。

方法：利用分子克隆的方法将丹参JAZ1基因构建到原核表达载体pET32a上，转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中进行诱导表达。

结果：对影响重组蛋白表达的4个因素，即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、及IPTG添加时间进行优化，确定丹参SmJAZ1重组蛋白最适表达条件。

IPTG浓度对目的蛋白的表达量没有显著影响；随诱导时间和诱导温度增加，SmJAZ蛋白的表达量增加；而IPTG添加时间对蛋白的表达量有明显影响。

结论：丹参JAZ1蛋白在30 ℃温度条件下，重组菌生长2 h（A600=0.9），加入0.1 mmol·L-1浓度的IPTG，诱导20 h后，表达条件最合适。

[关键词] 丹参；JAZ1；原核表达；条件优化[稿件编号] 20120927008[通信作者] *申业，Tel：（010）64014411-2956，E-mail：shenye@；*黄璐琦，E-mail： huangluqi@ 茉莉酸（JA）和它的衍生物（JA-Ile）是植物体内广泛存在的一种植物激素，参与植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫和次生代谢调控。

JAZ（jasmonate ZIM-domain）转录抑制蛋白是JA信号通路重要成分，在茉莉酸信号传导途径中起着重要的调控作用。

通常，植物体内JAZ蛋白与MYC2等转录因子结合，从而抑制了JA早期反应基因的表达；当植物受到环境胁迫时，体内具有生物活性的JAs积累，比如JA-Ile[1]，JA-Ile促进SCF COI1与JAZ二聚体的结合，形成COI1-JA-Ile-JAZs复合体，随即JAZ被多聚泛素化，进入到26S蛋白酶体降解，使得有活性的MYC2被释放，从而启动了茉莉酸响应基因的转录[2]。

。
04
应用前景展望
在生物制品领域的应用前景
1 2
疫苗生产
利用PET系统进行原核表达，可实现疫苗抗原的 高效制备，降低生产成本和时间。
抗体药物生产
通过PET系统表达抗体，能够简化抗体药物的生 产流程，提高生产效率和产品质量。
3
生物制品质量控制
PET系统可用于生物制品质量控制，如蛋白质结 构鉴定、功能检测和残留物质检测等。
疾病机制研究
PET技术可用于研究疾病的发 生机制、发展过程和治疗方法 ，有助于深入了解疾病的本质
。
医学影像诊断
PET技术能够提供高灵敏度和特异 性的医学影像，有助于肿瘤、神 经系统疾病等疾病的早期诊断。
生物医学材料研究
通过PET技术对生物医学材料进行 标记和检测，能够提高材料的安全 性和有效性。
05
培养基
提供实验菌种生长和繁殖所需的营 养成分。
试剂和仪器
包括各种分子生物学试剂和细胞培 养设备，用于实验操作。
实验方法
活性检测
通过生物学活性检测，评估目的蛋白的功 能和效果。
目的基因克隆
将目的基因从染色体或质粒上克隆到表达 载体中。
表达载体转化
将克隆好的表达载体转化到实验菌种中。
蛋白纯化
采用各种纯化技术，将目的蛋白从细胞中 分离出来。
诱导表达
通过添加诱导剂或其他方法，启动目的基 因的表达。
02
实验结果
pet系统表达的蛋白质量分析
总结词
在利用PET系统进行原核表达的过程中，需要关注蛋白的质量和产量。
详细描述
通过SDS-PAGE和Western Blot分析，可以检测到目标蛋白的分子量标准，同时利用定量蛋白试剂盒可以测定 其浓度。

融合表达载体 pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩【摘要】目的：设计合成小泛素修饰物-成纤维细胞生长因子受体4（SUMO-FGFR4）基因，构建 pET22b-SUMO-FGFR4表达载体，并对其表达条件进行优化。

方法：采用 Overlap PCR 方法制备 SUMO-FGFR4融合基因，并连接到原核表达载体 pET22b 中，获得 pET22b-SUMO-FGFR4重组表达载体。

以乳糖为诱导剂，观察乳糖浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间和乳糖的添加方式等因素对SUMO-FGFR4蛋白表达量的影响，确定最佳诱导条件，并进行重组蛋白的可溶性分析。

结果：pET22b-SUMO-FGFR4表达的融合蛋白在相对分子质量40000处显示目标条带，并与 FGFR4抗体特异性结合。

融合蛋白在乳糖终浓度为1.0 g·L－1、诱导时间为3 h、诱导时机 A （600）值为0.8、诱导温度为37℃时表达量最高，乳糖的添加方式对 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量无明显影响。

乳糖作为诱导剂比传统诱导剂 IPTG 诱导 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量高7.5％，融合蛋白以包涵体形式为主。

结论：以乳糖作为诱导剂，成功表达了 SUMO-FGFR4融合蛋白，确定了融合蛋白的最佳表达条件。

%Objective:To design the small ubiquitin modification-fibroblast growth factor receptor 4 (SUMO-FGFR4) fusion gene and construct the expression vector pET22b-SUMO-FGFR4, to optimize the expression conditions. Methods:The SUMO-FGFR4 fusion gene was obtained by Overlap PCR and was connected to pET22b;the recombinant expression vector pET22b-SUMO-FGFR4 was obtained. The influence of lactose concentration, induction time,induction temperature,induction point and adding mode of lactose in the expressionlevels was observed,and the best induction condition was determined; then the solubility of recombinant protein was analyzed.Results:The SUMO-FGFR4 fusion protein was highly expressed,the molecular weight of the fusion protein was about 40 000 and it could bind with FGFR4 specific antibody.When the lactose concentration was 1.0 g·L-1 ,the induction time was 3 h,the induction temperature was 37℃,the value of A (600)was 0.8,the expression level was highest;but adding mode of lactose had no remarkable effect on the protein expression.The expression level of recombinant protein induced by lactose was higher than IPTG.SUMO-FGFR4 protein existed in a form of inclusion body.Conclusion:The SUMO-FGFR4 fusion protein is expressed successfully in this study while lactose is used as inducer and the best expression conditions are confirmed.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(042)004【总页数】6页(P642-647)【关键词】小泛素相关修饰物;成纤维细胞生长因子受体 4;重组融合蛋白类【作者】刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩【作者单位】吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013【正文语种】中文【中图分类】Q78;R73-3小泛素相关修饰物 (small ubiquitin-like modifier，SUMO)是由约100个氨基酸组成的保守多肽家族，作为融合标签和分子伴侣可提高重组蛋白的可溶性和稳定性[1]，有利于重组蛋白的正确折叠。

原核表达条件优化E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。

由于V ector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。

本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。

pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。

ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。

而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。

功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。

缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。

表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。

【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。

这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。

本实验证实约60%以上的细菌无质粒。

鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【摘要】根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度.结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37C、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】6页(P52-57)【关键词】溶藻弧菌;dtd;基因克隆;原核表达;条件优化【作者】陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;仲恺农业工程学院,广东广州510225【正文语种】中文【中图分类】S941溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，又名藻朊酸弧菌、解藻酸弧菌、解藻朊酸内克氏菌[1]，是一种嗜盐嗜温、兼性厌氧的海生革兰氏阴性短杆细菌。

原核表达系统三大要素的选择及优化(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

优化表达条件： 优化表达条件：
A. 增加蛋白溶解性及折叠
在 E.coli中表达的重组蛋白经常以聚集的形式表达，被称作包涵体 包涵体。 包涵体 即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于PET 系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会 有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速 率，如降低诱导培温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可 溶性增加。在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在。
B.稀有密码子 B.稀有密码子
多数氨基酸都有一个以上的密码子，对E.coli密码子应用情况的分析表明一些密码 子很少使用。尤其是Arg密码子AGA,AGG,CGG,CGA,Ile密码子AUA,Leu密码子 CUA,Gly密码子GGA和Pro密码子CCC很少被用到。当异源目的基因的mRNA在E.coli 中过表达时，tRNA的数量直接反映了mRNA的密码子偏倚性。由于一个或多个tRNA的 稀有或缺少可能导致翻译的停止。不充足的tRNA库可能导致翻译延迟、成熟前翻译终 止、翻译移码和氨基酸错配。RosettaTM菌株被用来增加含有稀有Arg密码子AGG和 AGA，Ile密码子AUA，Leu密码子CUA,Pro密码子CCC和Gly密码子GGA目的蛋白的表 达。tRNA由一个与pET载体相容的氯霉素抗性质粒(以pACYC为骨架)带有的自身启动 子所表达。含有pLysS的Rosetta菌株在带有T7溶菌酶相同骨架上带有编码稀有密码子 的基因。Rosetta菌株是lon和ompT蛋白酶缺陷型的一个B-衍生菌。RosettaBlueTM和 Rosetta-gamiTM菌株分别衍生于K-12 NovaBlue菌株和Origami菌株。RosettaBlue还具 有高转化效率，以及由高水平lac阻遏子(lacIq)所带来的严紧性控制。Rosetta-gamiTM 菌株是trxB/gor突变株，通过形成二硫键促进蛋白折叠（二硫键形成及可溶性增强）。 Rosetta菌株相当适合用于表达那些含有E.coli稀有密码子基因的目的蛋白。

原核表达条件优化【专题讨论】原核表达条件优化！之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。

Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。

已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。

Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。

pET 系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。

T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。

T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。

并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。

从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。

如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。

根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。

原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

pet28a原核表达载体的表达原理Pet28a原核表达载体是一种常用于原核生物中蛋白质表达的载体。

它的表达原理基于其构建的特点和作用机制。

Pet28a原核表达载体的构建特点是将多个功能元件组合在一起，以实现高效的蛋白质表达。

主要包括启动子、编码序列、标签序列和终止子等。

Pet28a的启动子是一段能够识别并与细菌RNA聚合酶结合的序列，用来启动基因的转录。

细菌RNA聚合酶在启动子的识别下，能够将DNA的信息转录成mRNA，作为蛋白质合成的模板。

编码序列是Pet28a中最重要的部分，它包含了目标蛋白质的编码信息。

编码序列是由一串三个核苷酸组成的密码子序列，每个密码子对应一个氨基酸。

在细胞内，mRNA会被核糖体识别并通过翻译作用将其转化为氨基酸序列，从而合成出目标蛋白质。

Pet28a载体中还包含了标签序列，用于方便对目标蛋白质进行检测和纯化。

常用的标签序列有His标签和GST标签。

His标签是一段连续的组氨酸序列，能够与金属离子亲和层析柱结合，实现目标蛋白质的纯化。

GST标签是谷胱甘肽S-转移酶标签，能够与谷胱甘肽结合，实现目标蛋白质的纯化。

Pet28a载体的终止子是一段能够识别并终止转录的序列。

在RNA聚合酶到达终止子时，转录过程会终止，mRNA链被释放出来，进一步被核糖体翻译为蛋白质。

总结起来，Pet28a原核表达载体的表达原理是通过启动子识别和RNA聚合酶的转录作用，将编码序列转录为mRNA。

然后，mRNA通过核糖体的翻译作用，合成目标蛋白质。

最后，通过标签序列的存在，可以对目标蛋白质进行检测和纯化。

Pet28a原核表达载体的表达原理使其成为研究人员在原核生物中高效表达蛋白质的重要工具。

它的构建特点和作用机制为研究人员提供了方便、快捷和可靠的蛋白质表达平台。

通过对Pet28a载体的合理设计和选择，可以实现目标蛋白质的高效表达，为生物学研究和工业生产提供了有力支持。

原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。

基因治疗载体
pet-28a表达载体可以作为基因治疗的载 体之一，将治疗基因插入表达载体中， 通过注射等方式导入患者体内，实现治 疗目的。
VS
基因敲除和敲入
利用pet-28a表达载体可以实现基因敲除 和敲入，通过将特定基因插入表达载体中 ，在细菌细胞内表达出具有特定功能的蛋 白，实现基因敲除或敲入的目的。
pet-28a表达载体的表达机制
T7启动子
pet-28a表达载体中的T7启动子是一种RNA聚合酶的 识别位点，能够高效转录基因。
翻译机制
在pet-28a表达载体中，外源基因被转录成mRNA， 然后在核糖体上进行翻译，形成蛋白质。
蛋白质纯化
通过融合蛋白标签，使用亲和层析等方法对表达的蛋 白质进行纯化。
以pet-28a表达载体为主题 的PPT大纲
目录
• 介绍 • pet-28a表达载体的原理 • pet-28a表达载体的构建与优化 • pet-28a表达载体的应用实例 • 展望与未来发展方向
01
介绍
pet-28a表达载体的定义
01
02
03
pet-28a表达载体是一种常用的 原核表达载体，属于pET系列载 体。
05
展望与未来发展方向
pet-28a表达载体的改进与优化方向
1 2
提高表达效率
通过基因工程技术手段，优化pet-28a表达载体 的启动子、增强子和终止子等元件，提高目的基 因的表达水平。
扩大应用范围
针对不同物种和细胞类型，对pet-28a表达载体 进行改造和优化，以适应更广泛的应用场景。
3
安全性提升
生物科学研究领域
pet-28a表达载体作为一种重要的基因操作工具，在生物科学研究领域具有广泛的应用前景。例如，可用 于研究基因功能、细胞信号转导、组织器官发育等生物学过程。

科研
PET-MRI能够用于研究肿瘤生长和转移、药物代谢和疗效评估等科研项目，为新药研发和 疾病治疗提供帮助。
药物研发
PET-MRI能够用于监测药物在体内的分布、活化度和代谢过程，有助于药物研发和优化治 疗方案。
pet系统的发展历程
1970年代
PET技术开始发展并应用于临床诊 断。
1990年代
MRI技术开始应用于临床诊断，并 开始出现将PET和MRI技术结合的研 究。
加强质控和安全性
通过建立完善的质控体系和加强产品安全性评估 ，提高产品的质量、安全性和可靠性。
THANKS
2000年代初
第一台PET-CT问世，随后PET-MRI 技术也开始进入临床试验阶段。
2010年代
PET-MRI技术逐渐成熟并开始广泛 应用于临床诊断、科研和药物研发 等领域。
02
原核表达系统概述
原核表达系统的定义
原核表达系统是一种在原核生物中利用基因 工程技术表达特定基因产物的技术平台。
原核表达系统以原核生物的基因组、质粒或 噬菌体为载体，通过基因重组将目的基因插 入表达元件，转化原核细胞并表达目的蛋白
白的生物学活性。 • 安全性：原核表达载体可能含有致病基因，对人类和环境存在潜在危害。 • 蛋白纯化：原核细胞表达的蛋白质可能存在不稳定性，需要纯化以消除杂质影响。
03
pet系统与原核表达系统的关系
pet系统中原核表达系统的应用
01
生产重组蛋白
通过原核表达系统，生产具有生物活性的重组蛋白药物，如胰岛素、
存在毒性
某些原核表达系统生产的重组蛋白可能存在毒性，需进行去除毒性处理。
04
原核表达系统的下游应用
基因鉴定
基因序列验证