辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法
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HRP 的NaIO4标记法
一． 原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。
Note:
1. 产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。
2. HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。可通过控制NaIO4的量或控制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。当糖基的氧化度为20～25%时，有较高的结合效率。
3. 为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。光照可加快过碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。
4. 反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。
二． 酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。
三． 酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL） 1. 称取HRP x mg。当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮解。称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶解HRP的器具中。在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。HRP尽量不要回倒，以防污染。当HRP量小于10 mg时，溶解器具可用干净Eppendoff tube，HRP量大于10 mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。
2. 加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用搅拌子适速搅拌溶解。注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。
3. 称取x mg NaIO4，加ddH2O x/20 mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于x mg，可先配制成20 mg/mL，取适当体积来使用）。
4. 往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。
5. 将混合好的溶液置于4℃，静置20 min（颜色为绿色）。
6. 取x μL乙二醇溶于z mL DDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值尽量小，大约为总体积的1/20。
7. 室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。
8. 酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。
Note:
在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。活化酶所用的溶解水应为Ulterpure water。
四． 待标记蛋白的准备及标记（避光。防污染）
1. 样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL 左右，抗原一般要求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。
2. 用pH9.6左右的50mM CB（1×CB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。
（HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。一个原则是不能让氧化好的HRP等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。）
3. 将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mM pH9.5 CB中透析6小时以上，头两个小时换液一次。
4. 用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2x mg。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加到透析袋的体积是一个合适的体积。袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一点，反之亦然。）
5. 用pH8.0的20mM TBS或pH7.2的10mM PBS透析过夜。应换液多次，尽量除去NaBH4（NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。如受条件限制，一次也可。
Note:
拿捏透析袋应戴手套。
五． 成品酶的保存：
加等量的甘油，混匀后-20℃保存。
六． 附录：
附录1：（标酶过程所用Buffer）
TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。
10×（pH8.0 20mM）TBS的配制：
20×（pH9.6 50mM）CB的配制：
20×（pH7.0 10mM）PBS的配制：
Na2HPO4·12H2O 43.7g NaH2PO4·2H2O 12.16g
NaCl 170g 加水至 1000mL。
附录2：标酶实例（99.9.10）：
抗原名称 HIV-Env9 梅毒4717 梅毒4715
抗原浓度（mg/mL） 0.5 0.25 0.5
抗原体积（mL） 1.0 0.5 0.5
标记比例 1：2 1：2 1：2
HRP用量（mg） 1.0 0.25 0.5
HRP浓度（mg/mL） 10
HRP体积（mL） 0.1 0.025 0.05
NaBH4用量（mg） 0.2 0.05 0.1
NaBH4浓度（mg/mL） 10
NaBH4体积（μL） 20 5 10
1. 酶的氧化（避光）：
称取HRP 2.4mg，加ddH2O 100μL；
称取NaIO4 5.4mg，加ddH2O 270μL；
取NaIO4溶液120μL缓慢加入到HRP溶液中；
4℃避光放置30min；
取2.4μL乙二醇，加入20μL ddH2O，混匀，加到HRP溶液中；
室温静置30min；
酶的氧化过程完成，总体积为240μL，浓度为10mg/mL。
2. 抗原的标记：
抗原蛋白已于前一天用50mM CB透析完成；
在抗原溶液中分别加入10mg/mL的HRP 100μL（HIV-Env9），25μL（梅毒4717），50μL（梅毒4715）；
50mM CB透析6小时以上，头两个小时换液一次；
称取NaBH4 4.6mg，加入ddH2O 460μL，浓度为10mg/mL，分别加入到标酶溶液中20μL（HIV-Env9），5μL（梅毒4717），10μL（梅毒4715），摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次；
用pH8.0的20mM TBS透析过夜，其中换液三次即可。
从透析袋中取出样品，加等体积甘油混匀，-20℃保存。
附录3：（用夹子夹透析袋的方法）
在夹夹子时应排尽袋子里的气泡，如有气泡则袋子易浮于Buffer上，透析效果不好，并有生物活性原料易失活等弊端。
