lab7辣根过氧化物酶标记抗体.ppt

酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。

用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。

（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。

此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。

HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在pH3.5～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。

凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。

供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。

前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。

后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。

❖ 保存：加入1/8体积的异丙醇，分装，置于铅罐重-20 储存备用，避免反复冻融来自精选PPT21
酶标记技术
❖ 通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶 标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色 的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有 色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查， 也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存 在，从而证明了发生了相应的免疫反应
❖ 在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体 金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物
❖ pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗 粒的负电荷相互排斥而不能互相结合
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❖ 透析除盐：除去蛋白质中多余的电解质 ❖ 去除蛋白质中的沉淀：离心 ❖ 标记：用K2CO3或HCl调节金溶液至所需pH
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❖ 氯胺T法：
原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯 酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子， 使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少 量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射 性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成 带有放射性的化合物
优点：标记效率高，重复性好，试剂便宜易得
第十五讲 抗体的标记
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抗体的纯化原理、方法
❖ 抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏 水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进 行分离、纯化
❖ 根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法 ❖ 标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化
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抗体的预处理
❖ 过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒 ❖ 低速离心：去除细胞残渣及小颗粒物质，适用于 血
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4.5 显色: 每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处5～30min。 当显示橙色时应及时终止反应。
4.6 终止反应:每孔加入5OμL 2mol/L H2SO4。稳定3～5min即可比 色测定。
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4.7 检测: 用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对照、测波长为 49Onm时各孔光吸收（A）。
艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体
1. Direct elisa different epitope Coat with prey protein Incubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein ----直接酶联免疫吸附试验不同表位 外套与猎物蛋白 孵化与诱饵蛋白 原发性抗体抗诱饵蛋白
(1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被 物应具有较高的纯度，其浓度一般在1～100μg之间，在偏碱条件下易吸附 于反应板的凹孔中，4℃放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为 0.02% NaN3，4℃贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存 放3个月以上不影响测定效果。
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(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
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免疫标记技术
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标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定

《抗体标记》PPT课件
这是一份关于《抗体标记》的PPT课件，将深入介绍抗体标记的概念、种类、 优化以及在生物学研究和临床诊断中的应用。
前言
抗体标记是一种重要的实验技术，本节将介绍抗体标记的概念，并强调其在生命科学研究中的重要性。
抗体标记的种类
1 直接标记法
直接将荧光染料等标记 物与抗体结合，用于检 测分子的位置和表达程 度。
2 间接标记法
3 双抗体桥联法
先与荧光或酶标记的二 抗结合，再与抗体结合， 增强信号强度和灵敏度。
利用两种抗体中间的非 特异性结合，将第一次 结合的抗体标记与信号 放大剂结合。
抗体选择与优化
抗体选择时需注意抗体的交叉反应性和特异性，而抗标记优化涉及浓度、免疫原选用和反应条件的调节。
抗体标记在生物学研究中的应用
辅助肿瘤标记物的检测，用 于早期诊断和疗效评估。
自身免疫疾病诊断
检测自身免疫抗体，用于诊 断类风湿性关节炎等疾病。
总结
抗体标记技术具有广泛的应用前景，并具备许多优点和局限性。展望未来， 我们可以进一步探索其发展方向，以满足更高水平的研究和诊断需求。
参考文献
• Smith A, et al. (2019) Abcam. Antibody Conjugation Guide. Abcam. • Jones B, et al. (2020) Molecular Probes. Antibody Labeling and
免疫组化
用来检测蛋白质在 细胞和组织中的表 达情和分布。
免疫印迹
用于检测蛋白质的 相对含量和分子量。
流式细胞术
通过标记细胞表面 抗原，用于细胞鉴 定和分类。
免疫沉淀
用于分离和富集特 定蛋白质相互作用 复合物。