肿瘤细胞中长春新碱的高效液相色谱法测定

硫酸长春新碱含量测定的操作标准规程长春花为夹竹桃科植物长春花Catharanthus roseus的全草，迄今从中已经分离出70余种生物碱，其中对长春新碱和长春碱的应用最为广泛”。

长春新碱是二聚吲噪类化合物，主要存在于长春花叶中，是临床常用的一种广谱抗肿瘤药，主要用于治疗急性淋巴细胞性白血病、霍奇金病和恶性淋巴瘤等。

长春新碱为白色粉末，具有引湿性，遇光或热易变黄，2010年版（中国药典）（二部）用紫外分光光度法测定注射用硫酸长春新碱粉针剂。

目前随着各种新剂型的不断出现，其所用辅料的不断变化，可能会对紫外分光光度法定量测定造成一定的干扰。

而高效液相法由于其分离效能高，灵敏度好等优点。

对照品溶液的制备精密称取硫酸长春新碱对照1.0244mg，加流动相定量稀释至5.0mL，摇匀，作为对照品溶液，用前新鲜配制。

供试品溶液的制备取硫酸长春新碱粉针剂1瓶，精密称定，加流动相1mL溶解转入5mL量瓶，并用流动相多次洗涤容器，洗液并入量瓶中，稀释至刻度，摇匀，既得。

红细胞载体的特性及其抗肿瘤应用概述摘要红细胞载体是一种包入或连接外源性物质重新回输到人体或动物体内的一种药物载体。

其作为机体的有机组成部分，相较于其他载体，如脂质体等外源性载体，具有不可比拟的生物相容性及自降解性等性质。

此外，红细胞能够识别、黏附、提呈肿瘤抗原，此外红细胞能够促进免疫细胞吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力，因此红细胞在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

本文通过研读一些国内外文献，对红细胞载体的特性作出归纳并列举了其在抗肿瘤方面的应用实例。

关键词红细胞载体缓释性靶向性概述作为传统的微粒及纳米粒子替代品，细胞系统作为药物的生物载体近年来得到了广泛的关注。

细胞载体将药物、酶和遗传物质等活性物质持续地释放，特定地输送到某些器官和组织，在治疗癌症、艾滋病、细胞内感染、心血管疾病、帕金森病或基因疗法等方面表现出潜在的应用价值。

正常情况下，红细胞的主要功能是通过其所含血红蛋白来携氧，在体内循环数周。

由于红细胞具有渗透活性，其膜有可以开关的孔，允许外源分子进入，因此包入外源物质的红细胞重新回输到人体或动物体内成为载体红细胞。

根据药物与红细胞载体的结合形式，红细胞载体主要分为细胞内埋型及细胞膜连接型。

研究表明，以红细胞为基础的载体能有效地克服生理屏障，降低毒性和提高疗效，适用于复杂生物大分子药物的靶向治疗，具有良好的应用前景。

1.红细胞药物载体的特点1.1优良的生物相容性及残体自降解性红细胞作为机体自身的有机组成部分具有其他任何外源性载体不具备的生物相容性及残体自降解性，另外，若使用患者自身的红细胞组织培养后进行载药，还可避免免疫系统的干扰，很大程度地提高了药物的安全性和耐受性。

1.2增加药物体内半衰期，具有缓释性研究表明[1]，采用高渗法制备的甲氨蝶呤红细胞载体，利用反向高效液相色谱法测定雄性SD大鼠给分别给药普通静脉甲氨蝶呤制剂及甲氨蝶呤红细胞载体制剂后0，5,10,30,60,120,180,240,360,480,600,720,1440min各时间点血浆中甲氨蝶呤浓度，计算出相应药动学参数对比显示，甲氨蝶呤红细胞载体较甲氨蝶呤普通制剂具有更平稳的血药浓度曲线，更长的体内保留时间，表现出缓释效应和特征。

第39卷　第3期大庆师范学院学报Vol.39　No.3 2019年5月JOURNAL OF DAQING NORMAL UNIVERSITY May,2019DOI10.13356/ki.jdnu.2095-0063.2019.03.019抗癌药物长春新碱的研究进展张丽霞,赵晓菊,张奕婷(大庆师范学院生物工程学院,黑龙江大庆163712)摘　要:长春新碱是从草本植物长春花中提取出来的重要次生代谢产物,是应用最广的天然抗癌药物㊂综述长春新碱提取㊁分离纯化㊁含量测定㊁生物合成与代谢调控对其药效的影响,以期为长春新碱规模化生产和有效利用提供依据㊂关键词:长春新碱;提取;分离纯化;生物合成;代谢调控作者简介:张丽霞(1972-),女,黑龙江绥棱人,教授,博士,从事药用真菌多糖的结构和生物活性研究㊂基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(QC2015042);大庆师范学院博士启动基金项目(11NR16)㊂中图分类号:R979.1　文献标识码:A　文章编号:2095-0063(2019)03-0088-04　收稿日期:2018-11-23长春新碱(vincristine VCR)是从双子叶纲㊁龙胆目㊁夹竹桃科长春花中提取出来的一种双吲哚型生物碱[1]㊂分子式为C46H56N4O10,为目前应用最广的天然抗癌药物,主要用于治疗急性淋巴白血病㊁何杰金氏病㊁乳腺癌㊁恶性淋巴瘤和小细胞肺癌等疾病[2],通过作用于细胞微管蛋白干扰其代谢,以达到抗肿瘤目的㊂近年来,VCR主要是从长春花细胞中提取㊁分离纯化出其结构单体,研究其药理作用㊁活性成分和结构表征㊂由于VCR在长春花植株体内含量极其微小,无法满足临床需要,因此急需通过提取㊁分离纯化的方法来提升含量㊂通过激活VCR生物合成途径和有效代谢调控,增加VCR生成量㊂笔者以VCR为例,对其生物提取㊁分离纯化㊁含量测定㊁生物合成和代谢调控进行介绍,以期为VCR工业化生产和有效利用提供数据支持㊂1　提　取目前,提取长春新碱的方法主要有:亲脂性有机溶剂提取法㊁超临界流体萃取法及生物技术提取法㊂1.1　亲脂性有机溶剂提取法由于VCR属于弱碱性生物碱,可采用水㊁稀有机酸代替碱润湿药粉,再用氯仿㊁苯㊁二氯甲烷等有机溶剂来提取㊂生产上通常采用水湿润药粉后再用苯提取,使大部分弱碱性物质被提出,利于分离纯化[3]㊂1.2　超临界流体萃取法(SFE)choi等[4]以碱化的超临界CO2为溶剂从长春花中提取㊁分离得到了VCR㊂SFE-CO2法具有常温㊁萃取率高㊁安全㊁无毒等优点,但也存在对水溶性成分溶出比较弱的缺点㊂1.3　生物技术提取法1.3.1　发酵工程杨显志等[5]采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法对长春花叶内生真菌进行分88离,筛选出了一株无孢菌群菌株97CY,产生了VCR㊂表明长春花内生菌株易于培养,通过育种手段和控制培养条件大幅度提高VCR含量,利于工业化生产㊂1.3.2　遗传转化工程遗传转化是指利用重组DNA㊁组织培养或种质系统转化等技术将外源基因导入植物细胞或组织中获得转基因植物技术[6]㊂孙敏等[7]通过离体培养㊁株系筛选,用发根农杆菌感染长春花,诱导长出毛状根,从中提取分离出了VCR,开辟出一条新的应用转化毛状根技术获得VCR次生代谢产物有效途径㊂随着培养技术不断改进和反应条件不断优化,控制VCR合成关键酶基因克隆并转化成功,一定会寻求到高产的长春花植株或细胞株,以实现VCR工业化和产业化生产㊂2　纯　化纯化方法主要有:柱色谱法及高效液相色谱-电喷雾-质谱法等㊂2.1　柱色谱法柱色谱法包括:一次过柱㊁两次过柱和多次过柱等㊂一次过柱:李晓蕾等[8]利用过碱性氧化铝柱,可除去极性较低的碳氢化合物及部分中性㊁酸性物质㊂VCR为中极性物质,导致流动相的极性不宜太高,一般用苯-二氯甲烷㊁苯-氯仿㊁苯-石油醚㊁二氯甲烷-氯仿㊁乙酸乙酯-石油醚等作流动相,以不同比例等度或梯度洗脱,获得洗脱产物VCR㊂目前,该法是工业规模化生产方法,但产品纯度低㊂两次过柱:Gunasekera[9]采用过羟丙基交联葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH20)和硅胶柱方法,将粗提的VCR,分别以二氯甲烷-甲醇㊁氯仿-甲醇以及1% 10%甲醇-氯仿作流动相,分段收集流分,即得所需的生物碱㊂多次过柱:Atta-ur-Rahman等[10]经氧化铝柱㊁过硅胶柱㊁制备型HPLC三次过柱分离纯化,均用乙酸乙酯-石油醚为流动相进行梯度洗脱,获得VCR纯品㊂但该法步骤多㊁收率低,不利于大规模生产制备㊂2.2　高效液相色谱-电喷雾-质谱法(HPLC-ESI-MS)Choi等[4]利用HPLC-ESI-MS分析了从长春花中分离得到的VCR㊂与常规检测手段相比,提取物的离子流色谱不需精制即可将VCR分离㊂HPLC-ESI-MS法具有从复杂植物材料中检测特殊化合物提供了一种简单㊁快速的方法㊂3　含量测定测定VCR含量的方法有紫外分光光度法和高效液相色谱法等㊂3.1　紫外分光光度法提取长春花中的总生物碱,以磷钼酸㊁苦味酸㊁碘化铋钾㊁磷钨酸㊁碘-碘化钾作为沉淀反应试剂,以对-二甲氨基苯甲醛㊁甲醛-浓硫酸溶液㊁钼酸钠-浓硫酸溶液作为显色反应试剂,通过紫外分光光度法对生物碱的相对含量进行测定㊂3.2　高效液相色谱法朱荣[11]采用高效液相色谱法测定注射用硫酸长春新碱的含量㊂测定条件:色谱柱为Agilent HC-C8,流动相为1.67%二乙胺水溶液-甲醇(38:62,V/V),流速为1.0mL/min,检测波长为297nm,柱温为35℃,进样量为10uL㊂硫酸长春新碱的检测质量浓度线性范围为0.032 3.2 mg/mL(r=0.9999);精密度㊁稳定性㊁重复性试验的RSD<1%;平均回收率99.3% 101.7%, RSD=0.6%(n=9)㊂该法灵敏度高㊁准确㊁可靠㊂4　生物合成VCR在长春花植株体内含量极其微小,合成路径很长,并且合成路径有多条支路[12],至今尚98未完全解析㊂双吲哚生物碱VCR是由单萜类生物碱长春质碱和文多灵在血红素类氧化酶地催化下,耦合生成中间产物a-3,4-脱水长春碱[13-15],然后转化为长春碱,长春碱再生成VCR㊂至今,由a-3,4-脱水长春碱到长春碱和VCR的转化过程仍不清楚,有待进一步研究㊂由于外界环境因素非常容易对植物体内次生代谢产物生物合成造成影响,因此在长春花盐胁迫生理调控方面做过相关研究㊂王景艳等[16]发现在50mmol㊃L-1NaCl胁迫下,长春花植株中吲哚生物碱含量显著提高㊂刘冲等[17]用外源色氨酸能够提高在海水胁迫下长春花生物碱的含量㊂盐胁迫可促进长春花吲哚生物碱合成量,但却降低了植物生物量,不利于生物碱生产㊂近年来利用外界提供细胞内部的信号物质和外界胁迫因子诱发植物次生代谢产物合成,来提高植物次生代谢产物产量㊂外源NO能够提高植物的耐盐性,促进盐胁迫下植物生长,有利于生物量增加,而且内源NO又是植物次生代谢网络调控的枢纽,在植物次生代谢过程中起关键作用㊂胡凡波[18]研究表明,0.5mmol㊃L-1SNP(NO供体硝普钠)能够较好地提高50mmol㊃L-1NaCl和100mmol㊃L-1NaCl胁迫下长春花幼苗VCR含量㊂因此,在不同浓度NaCl胁迫下寻找出最佳外源NO浓度,在提高长春花吲哚生物碱的同时长春花生物量没有显著降低,以达到显著提高长春花吲哚生物碱产量的目的,为提高长春花吲哚生物碱产量提供理论依据和实际应用价值㊂5　代谢调控VCR代谢途径包含了至少35个中间产物㊁36个催化酶㊁18个调控基因以及若干细胞组分[19-22],是一条受到高度调控的代谢通路㊂曾俊岚等[23]选取长春花生物碱(TIAs)途径上的CPR㊁LAMT㊁SLS㊁STR㊁SGD㊁TDC㊁16-OMT㊁T16H及D4H等九个酶基因,分析其在各组织器官和MeJA处理下的无菌苗㊁毛状根和悬浮细胞中的数字表达谱,找出其中可能对MeJA信号响应的基因㊂研究发现:MeJA处理后,长春花无菌苗中以上九个基因表达量均发生上调;毛状根中除了TDC,另外八个基因表达丰度均为上调;悬浮细胞中除了D4H,另外八个基因表达丰度均上调㊂对整个转录组数据进行分析,发现经过Me JA处理后,仅有673条Unigene能在无菌苗㊁毛状根和悬浮细胞中均表现出差异表达,说明无菌苗㊁毛状根和悬浮细胞的MeJA应答机制明显不同㊂张楠等[24]通过在盐胁迫下施用外源进行处理长春花,研究外源对胁迫下长春花幼苗生理和吲哚生物碱变化的影响㊂发现干旱胁迫及施加氮素对长春花叶片中POD㊁TDC的活性及四种生物碱的含量均能产生影响,轻度干旱条件下施加氮素(LN)能显著提高文多灵㊁长春质碱㊁长春碱及长春新碱含量,这是通过提高全氮含量及酶活性来调控的㊂6　展　望分离与纯化VCR是药物研发的难点,分析测定是关键㊂关于VCR提取工艺改进㊁VCR类药物降低毒性的结构修饰工作以及VCR类药物的抗肿瘤作用机制将是人们研究的热点问题㊂目前,VCR分离纯化技术存在分离产量低及纯化成本高等劣势㊂由于不同植物中次生代谢不同,生物种类的多样性以及植物次生代谢自身的复杂性,次生代谢研究仍处于探索阶段㊂目前,长春花中VCR的生物合成途径研究尚不够深入,其合成途径阐述仍不够清晰,代谢酶发现还不完全,这些领域的突破将会为VCR抗肿瘤作用机理阐释和有效利用奠定基础㊂[参考文献][1]徐积恩.抗肿瘤药长春花生物碱的研究[J].中国医药工业杂志,1993,17(2):69-73.[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[S].2010.[3]肖崇厚.中药化学[M].上海:上海科学技术出版社,1997:94.09[4]CHOI Y H,YOO K P,KIM J.Super critical fluid extraction and liquid chronatography electrospray mass analysis of vinblastine from catharanthus from catharanthus roseos[J].Chem Pharm Bull,2002,50(9):1294-1296.[5]杨显志,张玲琪,郭波,等.一株产长春新碱内生真菌的初步研究[J].中草药,2004,35(1):79-81.[6]于兆海,陈刚.长春花生物碱的提取㊁分离㊁鉴定㊁制剂研究概述[J].中草药,2009,18(14):85-87.[7]孙敏,曾建军.长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的研究[J].中国中药杂志,2005,30(10):741-743.[8]李晓蕾,任其龙,杨亦文,等.抗肿瘤药长春碱的提取纯化与分析方法研究概况[J].中国医药工业杂志, 2004,35(4):247-250.[9]GEDEON R,VEGYESZETI G R T.Isolation of vinblastine and leurosine[P].Hung:153200,1966-10-22.(CA 1967,66:118854).[10]BASHIR M,HAFEEZ M,PERVEEN N,et al.A rapid procedure for the isolation of catharanthine,vindoline andvinblastine[J].Planta Med,1983,47(4):246-247.[11]朱荣.HLPC法测定注射用硫酸长春新碱的含量[J].中国药房,2006,27(3):407-409.[12]邢世海,王荃,潘琪芳,等.长春花萜类吲哚生物碱的生物合成途径[J].西北植物学报,2012,32(9):1917-1927.[13]匡雪君,王彩霞,邹丽秋.长春花萜类吲哚生物碱生物合成与调控研究[J].中国中药杂志,2016,41(22):4129-4137.[14]RISCHER H,ORESIC M,SEPPANENLAAKSO T,et al.Gene-to-metal-olite networks for terpenoid indolealkaloid biosynthesis in Catharanthus roseuscells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(14):5614. [15]LIU D H,JIN H B,CHEN Y H,et al.Terpenoid indole alkaloids biosynthesis and metabolic engineering in Ca⁃tharanthus roseus[J].J Integr Plant Biol,2007,49(7):961.[16]王景艳,刘兆普,刘玲,等.盐胁迫对长春花幼苗生长和生物碱含量的影响[J].应用生态学报,2008,19(10):2143-2148.[17]刘冲,刘玲,刘兆普,等.外源色氨酸对海水胁迫下长春花幼苗生长及生物碱的影响[J].两北植物学报,2008,28:2035-2040.[18]胡凡波.外源NO对盐胁迫下长春花幼苗生理及生物碱代谢的影响[D].南京:南京农业大学,2011.[19]RISCHER H,ORESIC M,SEPPANENLAAKSO T,et al.Gene-to-metabolite networks for terpenoid indolealkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(14):5614. [20]HEIJDEN R,JACOBS D I,SNOEIJER W,et al.The Catharanthus alkaloids:pharmacognosy and biotechnology[J].Curr Med Chem,2004,11(5):607.[21]FACCHINI P J,LUCA V D.Opium poppy and Madagascar periwinkle:model non-model systems to investigatealkaloid biosynthesis in plants[J].Plant J,2008,54(4):763.[22]BURLAT V,OUDIN A,COURTOIS M,et al.Co-expression of three MEP pathway genes and geraniol10-hydroxylase in internal phloem parenchyma of Catharanthus roseus implicates multicellular translocation of intermediates during the biosynthesis of monoterpene indole alkaloids and isopren oidderived primary metabolites [J].Plant J,2004,38(1):131.[23]曾俊岚,刘万宏,廖志华,等.长春花生物碱合成途径相关基因表达丰度与MeJA处理后基因表达差异分析[J].基因组学与应用生物学,2017,36(3):1009-1020.[24]张楠,温泉,冯辉,等.干旱胁迫及施加氮素对长春花生物碱的调控[J].中国中药杂志,2012,37(10):1346-1352.[责任编辑:崔海瑛]19。

高效液相色谱法检测XXX注射液药包材浸出物抗氧剂1010和3-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸摘要：本研究采用高效液相色谱检测XXX注射液中包装材料浸出物抗氧剂1010和3-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸。

用Poroshell 120 EC-C18为固定相，以乙腈-水（含0.1%冰乙酸）为流动相的梯度洗脱，以280nm的波长，300nm的参比波长的二极管阵列检测器进行检测。

结果表明，抗氧剂1010，3-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸分别在1.835～45.001μg/ml和0.601～7.700μg/ml范围内浓度与峰面积呈现良好的线性关系，在低、中、高三个加标浓度下的回收率分别为100.90%～106.57%和99.64～107.62%，精密度RSD（n=6）分别为0.34%和0.96%。

在XXX注射液药包材中抗氧剂1010和3-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸的检测限分别为0.915μg/ml、0.302μg/ml。

关键词：抗氧剂1010、3-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸、药包材相容性、浸出物，高效液相色谱引言抗氧剂1010是一种高分子量的受阻酚抗氧剂，挥发性很低，而且不易迁移，耐萃取，广泛应用于通用塑料，合成橡胶、墨水等行业中。

在药品与包装材料长期接触过程中，抗氧剂1010存在从包材中迁移至药品中的潜在风险，《化学药品与弹性体密封件相容性研究指导原则》1和《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究指导原则》2均明确将其列为需要关注的物质。

抗氧剂1010在与药品长期作用中可能发生水解，产生3-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸，后者的分子量更小，水溶性更好，可迁移性更强。

3这两种物质作为常见的浸出物对药品的安全属性造成潜在危害，需进行检测评估。

本文采用高效液相色谱对抗氧剂1010和3-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸进行检测，建立了有效的分析方法，并对方法的检测限、精密度、回收率进行了评估，为注射剂与塑料包装材料相容性研究工作提供技术支撑。