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牙鲆(Paralichthys olivaceus)糖原合成酶激酶-3 (GSK3)不同亚型的克隆及表达研究

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Open Journal of Fisheries Research 水产研究, 2015, 2(4), 74-84 Published Online December 2015 in Hans. /journal/ojfr /10.12677/ojfr.2015.24009文章引用: 王春丽, 林彤彤. 牙鲆(Paralichthys olivaceus )糖原合成酶激酶-3 (GSK3)不同亚型的克隆及表达研究[J]. 水The Cloning and Expression Analysis of Different Glycogen Synthase Kinase-3 (GSK3) Subtypes on Paralichthys olivaceusChunli Wang, Tongtong LinCollege of Marine Life, Ocean University of China, Qingdao ShandongReceived: Dec. 7th , 2015; accepted: Dec. 20th , 2015; published: Dec. 29th , 2015Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). /licenses/by/4.0/AbstractGlycogen synthase kinase-3 mainly includes two subtypes of GSK-3α and GSK-3β, whose catalytic activity area is highly homologous. GSK-3β can participate in multiple signaling pathways, includ-ing Wnt signal, affect the survival of normal cells and participate in the occurrence and develop-ment of the tumor. In this paper, we got GSK-3α, GSK-3β and GSK3β-like subtypes of Paralichthys olivaceus through gene cloning. NCBI Blast and NJ method built the system evolutionary tree; re-sults showed that the GSK3β-like subtypes are peculiar to the marine fish. Meanwhile, Megalign protein sequence alignment and SMART structure prediction revealed that the three different subtypes are highly homologous in functional domain. But, the qRT-PCR results showed that GSK-3β presents significantly higher expression than the other two subtypes during embryonic development, which may be related to that GSK-3β plays a major role in a variety of biological processes. KeywordsParalichthys olivaceus , GSK-3, Wnt, Embryonic Development牙鲆(Paralichthys olivaceus )糖原合成酶激酶-3 (GSK3)不同亚型的克隆及表达研究王春丽，林彤彤王春丽，林彤彤中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛收稿日期：2015年12月7日；录用日期：2015年12月20日；发布日期：2015年12月29日摘要糖原合成酶激酶-3 (Glycogen Synthase Kinase-3, GSK3)主要有GSK-3α和GSK-3β两种亚型，二者在催化活性区域具有高度的同源性。

GSK3β可以参与包括Wnt信号在内的多个信号通路的调控，影响正常细胞的生存并参与肿瘤的发生与发展。

本文以牙鲆为材料，通过基因克隆得到GSK-3α，GSK-3β和GSK3β-like 3个亚型，NCBI序列比对并经NJ法构建系统进化树，结果显示GSK3β-like亚型是海洋鱼类所特有的。

同时，Megalign蛋白序列比对及SMART结构预测显示3个不同亚型的功能结构域高度同源；但qRT-PCR结果显示，GSK3β在胚胎发育时期的表达量明显高于另外两个亚型，这可能与GSK3β在多种生物学过程中发挥主要作用相关。

关键词牙鲆，糖原合成酶激酶-3，Wnt信号，胚胎发育1. 引言糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是一种在进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，普遍存在于哺乳动物真核细胞中[1]。

它最早是在兔骨骼肌的分次提取物中被分离出来，在哺乳动物中主要有两种亚型，即GSK-3α和GSK-3β，二者在催化区域具有高达98%的同源性[2]，在N端和C端的非催化功能区同源性较差，是参与肝糖代谢的关键酶。

GSK3β功能多样，研究也最多。

不但可以通过对底物的磷酸化实现对Wnt信号通路的调控[3]，还可以在PI3K/Akt信号通路中作为下游蛋白，与AKT发生直接作用[4]。

同时，它还是胰岛素信号通路的关键调节因子。

GSK3β可以根据底物不同参与多个信号通路的调控，如底物磷酸化，亚细胞定位等[5]。

通过与多种蛋白及转录因子相互作用，参与细胞的增值、分化及凋亡等一系列生理过程[6]。

近年来研究发现，它还在癌症、神经精神类疾病的发病机制中具有重要作用，能够在癌细胞转录、细胞周期加速、肿瘤细胞的侵袭与转移等多个过程中起调控作用，GSK3β是众多恶性肿瘤中的关键激酶，虽然在肿瘤发生中的具体效应还不确定，在肿瘤发生中的作用已经被充分证实[7]。

众多研究发现，肿瘤中无论Wnt/β-catenin通路还是PI3K/Akt信号通路通常都会处于异常活跃状态，在许多肿瘤如胃癌，结直肠癌、胰腺癌中都可检测到活化的GSK3β的高表达情况[8] [9]。

因此GSK-3β在近年来成为多种疾病治疗中备受关注的可能靶点，受到越来越多研究者的重视[10]。

本篇文章通过分子克隆得到牙鲆GSK-3基因的GSK-3α，GSK-3β和GSK-3β-like3种亚型，并通过序列比对，蛋白结构预测及系统进化等对牙鲆GSK-3的3个不同亚型进行初步分析，并通过qRT-PCR研究了牙鲆GSK-3基因在早期胚胎发育过程中的时空表达变化。

2. 材料及方法2.1. 胚胎样品的获取及处理体外自然受精的牙鲆卵至于23℃(上下浮动1℃)的新鲜海水中孵育，期间保持充气，并隔日更换新王春丽，林彤彤鲜海水。

分别取受精卵、2细胞、16细胞、桑椹胚、高囊胚、原肠期(原肠早期、原肠晚期)、神经胚、尾芽、出膜期、出膜后、出膜12 h、出膜1 d和出膜36 h共14个胚胎发育早期典型时期的胚胎和仔鱼置于1.5 ml RNA-free的离心管中，每管固定30枚胚胎。

经PBS两次清洗后置于液氮中速冻，最后转移至−80℃中保存备用(注：因为没有关于胚胎发育时期该基因表达量的相关报道，我们只是随机挑取了14个胚胎发育时期进行检测)。

2.2. 总RNA的提取及定量模板的体外合成利用Trizol试剂法提取牙鲆各胚胎组织总RNA，经苯酚/氯仿初步纯化后利用异丙醇沉淀RNA。

初步纯化的RNA加入DNaseI去除DNA杂质后利用RNA clean纯化试剂盒(博迈德)除去残留的蛋白质，最后利用M-MLV反转录体系(Takara)体外反转录得到定量模板cDNA。

2.3. 蛋白功能结构域预测分析利用SMART在线网站初步预测牙鲆GSK蛋白的保守功能结构域，然后绘制牙鲆GSK蛋白家族的一级结构示意图。

2.4. 系统进化分析通过NCBI网站(/nuccore/?term=GSK)获得哺乳动物(人及家鼠)，两栖类(非洲蟾蜍)，淡水鱼类(斑马鱼)及部分海水鱼(半滑舌鳎，大黄鱼，眶锯雀鲷)的GSK3基因氨基酸序列，利用MEGA6软件，将上述7个物种的氨基酸序列与我们经分子克隆得到的牙鲆GSK3基因各亚型的氨基酸序列以邻位相连法(NJ)进行系统进化分析，并构建系统进化树。

2.5. qRT-PCR体外反转录得到的牙鲆胚胎各时期的cDNA，稀释到20 ng/μl作为荧光定量PCR的模板。

通过IDT 在线网站设计各基因的荧光定量引物，GSK3α-Fw：GGTAGGATGTTTGGGAGATGAG；GSK3α-Rv：ACCA CGGCCACACATAAA。

GSK3β-Fw：CTCTGCCCTGGTTCATCTTT；GSK3β-Rv：CTCTGCCCTGGTTCATC TTT。

GSK3β-like-Fw：CAGCTAAACTCGACCCTCATC；GSK3β-like-Rv：TGGTACTGAACT。

内参基因选取的是18S rRNA，其中18S rRNA-Fw：GGTAACGGGGAATCAGGGT；18S rRNA-Rv：TGCCTTCCTTG GATGTGGT。

但因为18S rRNA在组织中表达量极高，我们首先通过等比稀释将其模板稀释1000倍。

运用Light Cycler 480 (Roche Applied Science)进行qRT-PCR扩增，反应条件是95℃预变性(5 min)，然后(95℃15 s, 60℃45 s)共45个循环。

每个样品重复3次，取其平均值。

2.6. 数据分析通过2−△△CT法对3个基因qRT-PCR所得到的结果进行数据处理，根据分析得到的GSK3基因和18S rRNA内参基因的拷贝数，计算出目的基因的相对表达量。

最后用Prism6软件分析作图并利用SPSS 20.0软件进行方差显著性分析。

3. 结果3.1. 牙鲆GSK3三种亚型基因的克隆及蛋白功能结构域通过PCR扩增发现牙鲆GSK3基因包含3个亚型，GSK3α基因全长1323 bp，编码440个氨基酸；GSK3β基因全长1278 bp，编码425个氨基酸；GSK3β-like基因全长1320 bp，编码439个氨基酸(图1)。

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鱼类消化道微生物的组成和分布

鱼类消化道微生物的组成和分布

鱼类生活的环境和鱼类消化道中存在着大量的微生物，在鱼类生长发育过程中，鱼类消化道逐渐形成了一个由好氧菌、兼性厌氧菌和绝对厌氧菌组成的动态正常菌群。

正常情况下，鱼类消化道的各种微生物生长良好，占主导优势的有益微生物菌群能使消化道处于健康环境中，从而保证鱼类消化道的正常消化和吸收。

同时，有益微生物菌群定植于肠内壁黏膜，形成非特异性的生物保护屏障，抑制病原菌对肠壁的定植，维持肠道正常的微生态平衡。

但当出现饵料或环境变更等应激状态时，这种理想的微生物区系平衡会受到冲击，宿主的正常防御系统被破坏，某些条件致病菌会转移、定植并侵袭鱼体的其它组织器官，导致细菌性疾病的暴发[1]。

因此，如何利用益生素、化学益生素等调控鱼类消化道微生物的组成，保持鱼类消化道微生物区系平衡，维持动物健康正成为国际上的研究热点。

1鱼类消化道微生物的组成和分布鱼卵孵化前表面附着有大量的细菌，但刚孵化鱼的胃肠道通常是无菌的。

孵化后的仔鱼在卵黄囊消耗以前就会开始饮水，水中的细菌得以进入仔鱼的消化道。

稍大一点的仔鱼还会摄食附着有大量细菌的悬浮颗粒和卵黄碎片。

因此，养殖水体、悬浮颗粒和卵黄碎片的细菌成为仔鱼消化道微生物区系的最初来源。

但是，鱼类胃肠道环境不同于水体环境，仅那些能适应鱼类胃肠道环境和宿主的免疫系统的微生物能够定植于胃肠道。

研究表明，仔鱼期形成了最初的不稳定的微生物区系，随后此微生物区系逐渐成熟，幼鱼期形成比较稳定的微生物区系。

例如，罗非鱼（Tilapia mossambica）在孵化后20~60 d内建立起比较成熟的微生物区系[2]。

仔稚鱼免疫系统尚未发育完成，它们更多的是依赖非特异性防御机制，其中，胃肠道粘膜上附着的正常菌群可能是仔稚鱼对抗致病菌入侵的第一道屏障。

然而，由于传统方法的严重制约，特别是消化道微生物区系复杂多样且需厌氧环境，目前有关仔稚鱼消化道微生物的研究较少，仔稚鱼胃肠道粘膜上附着的菌群种类、功能和变化尚不清楚。

牙鲆科鱼类生物学特征生活习性等

牙鲆科鱼类生物学特征生活习性等

牙鲆科鱼类生物学特征生活习性等牙鲆科鱼类生物学特征、生活习性等牙鲆科鱼类的繁殖生物学全文总结研究了国外有关牙鲆科鱼类繁殖生物学方面的研究成果,以牙鲆和大菱鲆为例从其繁殖习性、亲鱼性腺发育规律、胚胎发育以及仔鱼形态特征等几个方面综述了牙鲆科鱼类的繁殖生物学特性。

关键词：牙鲆科牙鲆大菱鲆生物学特征产卵生物学牙鲆科（paralichthyidae）是鲽形目（pleuronectiformes）的一个科。

鳃盖膜互连,无鳍棘,偶鳍有分枝鳍条；有眼侧胸鳍,较长；腹鳍较短,近似对称，距峡部较远；两侧有侧线；肾脉突较多，肾脉棘叉状；第三上鳃骨有齿，尾舌骨钝钩状;有肋骨；尾下骨4块,与尾杆骨已愈合,在中国常见的有华鲆，分布于东海及南海近海，能进入长江以南的一些江河。

褐牙鲆，为暖温性底层凶猛鱼类,大者体长可达800毫米，是黄、渤海珍贵食用鱼。

斑鲆属的大牙斑鲆、五眼斑鲆和大鳞鲆属的大鳞鲆等。

身体呈圆形卵圆形，极为平扁。

双眼均坐落于身体的左侧方，有些则坐落于右侧方。

口Antorbital胸部，下颌较注重，牙齿繁盛。

鳃砌膜相连，前鳃砌骨後缘游离，并无皮膜或鳞片。

各鳍均并无软棘，背鳍已经开始于眼睛的上方，背鳍与臀鳍皆不低，短至尾柄前方，均不与尾鳍相连。

基底长，两侧边线不一定等距，但眼侧的腹鳍一定不少于盲侧的第一鳍条。

肛门趋向盲侧。

广泛分布于三大洋温带、热带及亚热带之近海。

主要栖息于较浅的大陆棚区，偏好沙泥底质的环境。

产飘浮性卵，受精后小鱼的外形和通常鱼类相同，身体左右等距，且先行飘浮性生活，蜕变后才至砂地上活动。

具备保护色，可以随外在环境之变化而发生改变体色。

利用背鳍和臀鳍缓缓的穿梭，碰到敌人，则可以转动身体及尾部快速游动或躲入砂中。

就是砂地上的隐形能手。

属于肉食性，平时于砂地上捕食小鱼及甲壳类等。

全世界16属于，分别就是弯角鲆属于(ancylopsetta)、头棘鲆属于(cephalopsetta)、副棘鲆属于(citharichthys)、圆棘鲆属于(cyclopsetta)、腹肢鲆属于(etropus)、y鲆属于(gastropsetta)、小庸鲽属于(hippoglossina)、牙鲆属于(paralichthys)、斑鲆属于(pseudorhombus)、Saucourt鲆属于(syacium)、小鳞鲆属于(tarphops)、花掉鲆属于(tephrinectes)、?鲆属于(thysanopsetta)、匿牙鲆属于(verecundum)、扇尾鲆属于(xystreurys)。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)外周血单个核细胞的离体培养和电生理特征研究

牙鲆(Paralichthys olivaceus)外周血单个核细胞的离体培养和电生理特征研究

够 贴壁 生长传 至 ６代 ，存活 ３ ０天 以上。单 核细胞 呈不规 则 圆形，细胞长 径为（２３ ±０６ ） １． ０ ． ｍ，短径 ２ 为（０２ ±１ ５ １． ９ ． ） ０ ｍ，并 具有 较 强 的吞 噬 活性，吞 噬率（ Ｐ 和 吞噬 指数 （， 别 达到（ １ ±３ ５％和 Ｐ ） Ｐ） 分 ６． ９ ． ） ０ １ ８ ．１ ． ±０５ ；淋 巴细胞 多呈 圆形或 椭 圆形，细胞 长 径 为（． ±０８ ） ５ ８５ ０ ．２ ｍ，短径 为（． ７４ ６±１ ７ ｍ，吞 ．） ０
的分 离、 化及 培养，并 采用膜 片钳技术 观察 了单核细胞 膜 的电生理特 征。 果表 明，牙鲆 外周 血单 纯 结 个 核细胞在 添加 Ｐ Ａ（０ｔ／ ） Ｍ１９２ ％ Ｆ Ｓ培 养液 中，于 ２ ｃ 塑料培养皿（ ｏ ｔ ，美 国） Ｈ ３ ￣ ｍ１的 ｇ ９ （０ Ｂ） ５Ｃ Ｃ ｓｒ ａ 中能
个 核 细胞 的分 离 和贴壁 培 养 研究 ，建立 牙鲆 单 个 核
细胞 实 用 培养 方 法 ，并 采 用膜 片 钳 技术 观察 了细胞 膜 离 子通 道 的种 类 和特 征 ，以期 为进 一 步 开展 免疫 机制研 究和 开发免疫 防治技 术奠定基 础 。
与 其 他鱼 类相 似 （ｌ ｓ ９ ７，牙 鲆 外周 血 细胞 Ｅｌ ，１７ ） ｉ
类 品种 。近年来 ， 水病 、病毒性神 经坏死 症等各种 腹
病害 的爆 发 和流行 给 生 产企 业造 成 了 巨大 的经 济损 失 ，严重阻碍 了牙鲆 养殖产业 的发展 。由于对牙鲆免 疫 机 理 和机 制 的 了解 较 少，尚无 有 效 的免 疫 防治 技
１８ ； ｏ ｇ ｔ ｅ ａ，１ ８ ；冯怀亮 等，１９ ） ９ ０ Ｄ ｇ ｅ ｔ ｌ ９ ７ ｔ ９ １，免疫 细 胞 表 面抗 原等 的研 究 （ 日琴 等 ， ０ ３，而关 于细胞 乌 ２ ０） 的功 能研究 较少，亦无 离体长期 培养 的研究 报道 。由 于 细 胞 膜 离 子 通 道 在 细 胞 免 疫 中发 挥 了关 键 作 用
牙鲆鱼、多宝鱼肌原纤维蛋白性质比较

牙鲆鱼、多宝鱼肌原纤维蛋白性质比较

牙鲆鱼、多宝鱼肌原纤维蛋白性质比较夏俪宁;贾慧;李琦;徐畅;董秀萍;潘锦锋【摘要】鱼类肌肉蛋白的组成与性质决定了其加工特性和产品特性.以牙鲆鱼和多宝鱼为研究对象,用SDS-PAGE分析二者肌肉蛋白的组成形式,采用差示扫描量热法(DSC)、动态流变仪研究二者肌原纤维蛋白的热变特性、流变特性,以及乳化性和起泡性等蛋白功能特性,并对以上性质进行比较.SDS-PAGE电泳结果显示牙鲆鱼肌浆蛋白在20.1～44.3 kDa间,较多宝鱼肌浆蛋白多两条特异条带,而牙鲆鱼肌原纤维蛋白在97.2～66.4 kDa处较多宝鱼多一条特异条带.DSC研究显示牙鲆鱼肌原纤维蛋白变性温度为39.98℃,高于多宝鱼的37.86 ℃,流变分析中,牙鲆鱼、多宝鱼肌原纤维蛋白损耗模量G"在30～40℃间均有流变特性转折点.二种鱼类肌原纤维蛋白的功能特性随着蛋白浓度的升高而降低.乳化性结果显示,低浓度时牙鲆鱼肌原纤维蛋白乳化活性高于多宝鱼.起泡性研究显示,低浓度牙鲆鱼肌原纤维蛋白起泡性低于多宝鱼,中与高浓度时高于多宝鱼.同时随着浓度的升高,多宝鱼起泡性趋于稳定.研究结果表明,牙鲆鱼及多宝鱼的蛋白组成二者肌原纤维蛋白流变特性-乳化特性以及起泡性等功能特性均有一定差异.%Composition and properties of fish muscle protein determines its processing characteristics and product features.In this study,Japanese flounder and turbot muscle were used as research materials,protein pattern of muscle was analyzed using SDS-PAGE,thermal properties and rheological properties were studied with DSC and rheometer.Emulsifying and foaming capability of myofibrillar protein (MFP) were also investigated.It is showed that SDS-PAGE electrophoresis analyses found distinct differences in myosinogen and MFP proteins between Japanese flounder and turbot muscle.Turbot muscle had different bands ina molecular weight range of 20.1 kDa to 44.3 kDa in myosinogen,Japanese flounder showed a different band in MFP proteins at 97.2～66.4kDa.Different scanning calorimetric (DSC) study showed that the denaturation point of flounder MFP was 39.98 ℃,higher than that of turbot MFP,which was 37.86 ℃.A peak was observed in loss modulus of flounder MFP and turbot MFP at range of 30 to 40 ℃.As protein concentration increased,emulsifying activity index (EAI),emulsifying stability index (ESI),foaming capability (FC)and foaming stability (FS)of myofibrillar protein showed a decreasing trend.It is showed that the ESI of flounder MFP was higher than that of the turbot at low concentration.FS of flounder MFP was higher than that of the turbot at medium and high concentration,the consequence at low concentration was opposite.As protein concentration increased,the foaming properties of turbot tend to be stable.The results showed that the muscle protein patterns with SDS-PAGE,and functional properties for rheological properties,EAI and FC of these two MFP all had significant differences.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)012【总页数】5页(P44-48)【关键词】牙鲆鱼;多宝鱼;肌原纤维蛋白;流变特性;热变特性【作者】夏俪宁;贾慧;李琦;徐畅;董秀萍;潘锦锋【作者单位】大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心辽宁大连116034;大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心辽宁大连116034;大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心辽宁大连116034;大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心辽宁大连116034;大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心辽宁大连116034;大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心辽宁大连116034【正文语种】中文【中图分类】TS254.2牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus),别名鲆鱼,为硬骨鱼纲、鲆科,是比目鱼的一类。