牛奶中体细胞数及检测
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目录一、引言 (2)二、我国生乳标准的变化以及与其他国家的差距 (2)2.1生乳中菌落数指标 (2)2.2生乳中蛋白指标 (3)2.3生乳中体细胞数指标 (4)三、我国奶业标准现状 (4)四、生乳标准变化背后我国奶业标准存在的问题 (5)4.1奶业标准结构不合理 (5)4.2我国奶制品质量标准与国际标准还有较大差距 (5)4.3现行标准重奶制品,轻生产过程 (5)4.4 相当一部分标准陈旧,不能适应现阶段需要 (6)4.5 标准被少数大企业控制 (6)4.6 行业协会组织结构不明确,政府缺少监管 (7)五、标准背后奶业标准利益人的博弈 (7)5.1 企业与企业之间的博弈简述 (7)5.2 政府和企业之间的静态博弈模型 (8)5.2.1 模型假设 (8)5.2.2 模型分析 (9)六、促进我国奶业标准改进的对策建议 (9)6.1政府方面 (9)6.1.1建立国家级奶业质量安全管理机构 (9)6.1.2参照国际标准,制定出我国的奶业质量标准体系 (10)6.1.3加快对奶业生产环节标准的制定与修订,规范企业行为 (10)6.1.4建立和完善奶制品检验检测体系 (10)6.2 企业自身方面——借鉴国外经验 (11)6.3 消费者方面 (12)七、结语 (12)参考文献 (13)附录 (14)从《生乳》标准变化看中国奶业标准摘要:随着国民经济的快速发展,人民对生活质量的要求不断提高,对奶产品的需求越来越大。
然而近年来由于奶业标准混乱所导致的问题比比皆是,进而引发了人们的持续关注。
为此本文主要以生乳标准变化引出对中国奶业标准现状的分析,提出奶业标准存在的问题并运用博弈论模型分析奶业标准涉及的各方利益较量,最后针对奶业标准改进给出意见建议。
关键字:奶业标准、博弈模型、奶业发展一、引言日前,在牛奶行业举办的内部研讨会上,广州市奶业协会理事长王丁棉直斥中国牛奶标准“全球最差”,“是世界乳业之耻”!自三聚氰胺事件之后,奶业标准混乱之弊屡被提及,中国牛奶消费信心至今未愈。
奶牛血清中维生素A和维生素E含量的测定及其与牛乳中体细胞数的相关性董淑慧;王加启;李发弟;彭华;张养东;赵海燕【摘要】利用高效液相色谱法测定奶牛血清中维生素A和维生素E的含量,并探讨其与牛乳中体细胞数的相关性.结果表明:奶牛血清中维生素A的加标回收率为93.8%~106.4%,维生素E的加标回收率为91.5%~105.3%,RSD分别为4.7%和4.4%,该方法简单快速准确可靠,可用于奶牛血清样品中维生素A和维生素E含量的测定.维生素E浓度在泌乳第4~8周与体细胞数呈弱负相关性(R=-0.25,P=0.037),在泌乳第10~14周为中等程度负相关(R=-0.41,P=0.037);维生素A与体细胞数不存在相关性.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2013(048)001【总页数】7页(P19-25)【关键词】奶牛;血清;维生素A;维生素E;体细胞数;相关性【作者】董淑慧;王加启;李发弟;彭华;张养东;赵海燕【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193【正文语种】中文【中图分类】S823.9+1维生素A和维生素E是动物机体维持正常代谢和机能的脂溶性维生素.维生素A具有保护上皮组织的完整性,维持细胞及细胞器膜结构的完整及正常的通透性,以形成阻止外源病原微生物入侵的屏障,可以增强和提高机体的免疫力.维生素E是存在于动物细胞膜上的一类抗氧化剂,可以缓解不饱和脂肪酸的氧化[1].监测奶牛血液中维生素A和维生素E的含量可以了解其免疫机能及氧化应激状态.维生素E 可以减少奶牛乳腺炎的发生率[2]、提高繁殖性能[3]和产奶量[4].目前,采用高效液相色谱法(HPLC)测定维生素A和维生素E的方法主要有2种:皂化-HPLC法和萃取-HPLC分流法.前者的前处理较复杂,而且测定结果不能反应维生素形态组分的生物活性;后者的前处理简单,能直接测定维生素的不同形态组分,虽然设备要求较高,但因其快速、准确,已在人类医学检查中广泛应用[5-6].Chew等[7]和Smith等[8]发现奶牛血液中维生素 A和维生素E与乳房炎均存在相关性,但Jukola等[9]发现血中维生素A与乳中体细胞数(SCC)存在相关性,但维生素E与SCC不存在相关性.在泌乳牛日粮中添加维生素A和维生E对乳房炎的影响的研究结果也不一致,一些研究发现在奶牛日粮中添加维生素A或维生素E可以减少乳房炎的发生[2,10],但 Persson等[11]和Whiteman等[12]发现泌乳牛日粮中添加维生素A和维生素E对乳中SCC无影响.本研究拟通过建立奶牛血清中维生素A和维生素E含量的HPLC测定方法,探讨维生素A和E与泌乳初期奶牛乳中SCC的关系,以期为生产中通过日粮中添加维生素A或维生素E控制奶牛乳房炎的发生提供理论依据.1 材料与方法1.1 试验动物在北京奶牛中心良种场选择33头经产荷斯坦奶牛,其产犊日期分布在2010年3月9日至2010年5月3日.试验开始前所有牛在产房饲喂干奶期日粮,产犊后大约14d,转入拴系式牛圈,饲喂泌乳牛日粮.每天投喂3次(7∶00,14∶00和21∶00时)TMR日粮,投料量为期望采食量的110%,并根据前几天的采食量进行调整,每次拴系饲喂2.5~3h.记录投料量和剩料量计算干物质采食量.1.2 样品采集1.2.1 血样采集试验牛于产犊后4、6、8、10、12和14周晨饲后1h从奶牛尾静脉采集血液,装入含有EDTA的采血管中,2 000 g离心20min,吸取上清液即血浆分装至600μL离心管中,-20℃冻存.1.2.2 奶样采集试验牛在采血前1d收集奶样,当天挤奶3次,按早∶中∶晚=4∶3∶3比例采集奶样50mL,加入重铬酸钾进行防腐处理,4℃冷藏保存.1.3 仪器与试剂高效液相色谱仪(Water 600)、高速台式低温离心机、氮吹仪、涡旋振荡器、电子天平、维生素A对照品(Retinol – synthetic,R7632,Sigma)、维生素E 对照品(DL-all-rac-α-Tocopherol、T3251、Sigma);甲醇、无水乙醇和正己烷均为色谱纯,过滤膜(2.2μm).1.4 色谱条件色谱柱为Atlantis C18,粒度5μm,250mm×4.6mm(i.D3);流动相为甲醇;流动相流速为1.0mL/min;柱温为室温进样量为10μL;检测波长为325nm (维生素A)和292nm(维生素E).1.5 溶液的配制1.5.1 维生素A储备液配制精确称取维生素A对照品10mg(纯度95%),加无水乙醇定容至10mL,配成维生素A储备液(1g/L).1.5.2 维生素E储备液的配制精确称取维生素E对照品40mg(纯度96%),加无水乙醇定容至10 mL,配成维生素E储备液(4g/L).1.5.3 维生素A、维生素E混合标准溶液的配制取维生素A储备液250μL,维生素E储备液400μL,用无水乙醇定容到10mL,配制成维生素A浓度为25mg/L,维生素E浓度为160mg/L的混合标准溶液.1.5.4 维生素A、维生素E混合标准应用液的配制精确吸取250μL的维生素A储备液用无水乙醇定容到10mL,稀释成25mg/L的工作液;精确吸取100μL维生素E储备液用无水乙醇稀释成40mg/L的工作液;吸取维生素A工作液250μL、维生素E工作液1mL定容到10mL,稀释为维生素A浓度为0.40mg/L、维生素E浓度为4mg/L的混合标准应用液.1.6 血清样品处理取400μL血浆,放入2mL离心管中,加入400μL无水乙醇,涡旋振荡2min,加入800μL正己烷,涡旋振荡2min,以12 000 g离心10min,取上层正己烷层至另一离心管中,残渣中再加入800μL正己烷,涡旋2min,10 000 g离心10min,用移液枪缓慢吸取上层全部正己烷,合并2次上清液,氮气吹干,加入1 500μL甲醇溶解,涡旋1min,经0.22μm的微孔滤膜过滤后,取10μL进样,整个过程要求避光.1.7 测定方法1.7.1 标准曲线的绘制精确加入维生素A、维生素E的储备液于10mL容量瓶中,用乙醇定容,使得维生素 A 的浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L,维生素 E 的浓度分别为0、2、4、6、8、10mg/L,将容量瓶中的标准工作液注入液相色谱仪中,得到峰面积,并以峰面积为纵坐标,以维生素A、维生素E标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线.1.7.2 加样回收率及重复性试验方法取同一血清2份各400μL,其中一份添加维生素A、维生素E混合标准溶液10μL,使得添加的维生素A在血清中的浓度为0.40mg/L,维生素E浓度为4mg/L,另一份不添加,操作方法同1.6,进样10μL,进行色谱分析,求得相应的浓度后,计算加标回收率.重复性试验:取同一血清5份,每份400μL,操作方法同1.6,进样10μL,进行色谱分析,求得相应浓度后计算浓度间相对偏差.1.7.3 空白对照取400μL超纯水,操作方法同1.6.1.8 牛奶中体细胞数的测定将奶样送至北京奶牛中心乳品质量监督检验测试中心测定体细胞数(SCC),并将SCC转化为体细胞得分(SCS),SCS=lg102(SCC/100 000)+3[13]. 1.9 数据处理血液维生素A和维生素E含量与牛奶中体细胞数之间的相关性利用SAS软件中Pearson相关系数进行分析.相关系数0.8~1.0为极强相关,0.6~0.8为强相关,0.4~0.6为中等程度相关,0.2~0.4为弱相关,0.0~0.2为极弱相关或无相关.高体细胞数及低体细胞数奶牛血液中的维生素E含量用SAS 9.0软件包中的GLM程序进行方差分析.2 结果与分析2.1 维生素A和维生素E的标准曲线以浓度(x)对样品的峰面积(y)进行回归,求得回归方程.维生素A标准曲线为y=32 743x+66.238,线性范围:0~1.0mg/L,R2=0.999 7(图1);维生素E标准曲线y=1 743.7x-135.14,线性范围:0~10.0mg/L,R2=0.999 4(图2).图1 维生素A标准曲线Fig.1 Standard curve of vitamin A图2 维生素E标准曲线Fig.2 Standard curve of vitamin E2.2 维生素A和维生素E的色谱图由图3~5可以看出,在本试验色谱条件下,维生素A和维生素E的保留时间分别为8.2min和4.5min,表明该试验所建立的样品处理方法和HPLC分析色谱条件能快速准确的测定荷斯坦奶牛血液中维生素A、维生素E的含量.此外,在本试验样本处理及色谱条件下,维生素A、维生素E和杂质能较好的分离,杂质对结果的测定干扰较小.图3 维生素A和维生素E的标准色谱图Fig.3 Chomatogram map of vitamin A and vitamin E in standard samples图4 血液样品中维生素A和维生素E的色谱图Fig.4 Chomatogram map of vitamin A and vitamin E in blood samples图5 样品的加标色谱图Fig.5 Chomatogram map of samples added standard sample of vitamin A and vitamin E2.3 加标回收率以维生素加标样品的色谱峰响应值减去维生素样品的响应值的差值与对应同浓度的维生素A、维生素E对照品溶液的响应值的比值计算提取回收率.维生素A加标回收率为93.8%~106.4%,维生素E加标回收率91.5%~105.3%;维生素A、维生素E平均回收率为102.44%、100.14%,RSD 分别为4.7%和4.4%,RSD<5%,试验结果表明用维生素A、维生素E标准品作外标定量,结果准确可靠. 2.4 重复性和精密度试验结果取同一血清5份,萃取维生素A、E,RSD分别为0.5%和1.2%,试验结果表明,该方法具有较好的重复性.取同一血清,萃取维生素 A、维生素E,以1mg/L和4mg/L维生素A、维生素E混合标准溶液,重复进样5次,相对标准偏差为1.8%(<2%),试验结果表明,该方法具有较好精密度,即重现性良好.2.5 奶牛血清中维生素A、维生素E的测定结果在所测得的142份血清中,维生素A的浓度为0.11~1.65mg/L,平均为0.49mg/L;维生素E的浓度为0.75~11.4mg/L,平均为3.70mg/L.试验结果表明,不同个体间或牛在不同泌乳周期血液中的维生素含量变化较大.2.6 奶牛血液中维生素A、维生素E浓度与牛乳中体细胞数的相关性牛奶中体细胞数低的奶牛其血清中维生素E浓度与高体细胞数奶牛血清中维生素E 浓度差异不显著,但体细胞数低的奶牛其血清中维生素E平均浓度与高体细胞数奶牛血清中维生素E平均浓度相比有升高的趋势,但泌乳第12周有相反的结果(表1).在不同的泌乳周期血液中的维生素E含量也存在差异,在泌乳第8周和第12周血液中的维生素E含量显著高于泌乳第10周和第14周(P=0.028).由表2可以看出,奶牛血液中维生素E浓度在泌乳第4~8周与体细胞数呈弱负相关性(r=-0.25,P=0.025);在泌乳第10~14周为中等程度负相关(r=-0.41,P=0.037),且在第10~18周体细胞数高时与维生素E浓度相关性更强;奶牛血液中维生素A浓度与体细胞数不存在相关性,但是在泌乳第10~18周高体细胞数奶牛其血清维生素A与体细胞数呈弱负相关(r=-0.36).3 讨论不同的样品前处理方法和分析色谱条件都会影响测定结果的准确度[14].而本试验所建立的样品处理方法和HPLC分析色谱条件取得了较好的加标回收率,样品中维生素A、维生素E保留时间分别为8.2min和4.5min,且重复性、精密度良好,表明该方法快速、准确,具有重现性好和回收率高的特点.表1 不同泌乳周期奶牛血样维生素E含量Tab.1 Serum vitamin E concentrations of cows of different lactation periodSCS值≥4界定为高体细胞数,SCS值<4界定为低体细胞数;同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).?表2 不同泌乳周期维生素A、维生素E浓度与体细胞数间相关系数Tab.2 Correlation coefficient of serum vitamin A,vitamin E concentration and SCCof different lactation dairy cows?生育酚主要有8种,按甲基位置分为α、β、γ和δ-生育酚,其中α-生育酚是奶牛体内最主要的生物活性形式,存在于血液和牛奶中,其中以α-生育酚的活性最强,且动物血液中90%以上都是α-生育酚,它也是饲料中维生素E的最主要存在形式[15].本试验通过高效液相色谱测定的是α-生育酚(标准品为α-tocopherol).很多学者通过不同方法研究泌乳奶牛血清中维生素E浓度范围,Smith等[16]用4.0μg/mL来界定血清中维生素E浓度是否处于合适水平,Weiss等[17]认为3.0~3.5μg/mL是正常奶牛血清中维生素 E 浓度的最低水平,Radostits等[18]将2.0 μg/mL定义为血清维生素E浓度临界水平,低于此将会出现缺乏症,血清维生素E浓度低于1.0~1.5μg/mL时对奶牛健康有害[15].在本试验中,血清维生素E浓度超过3μg/mL的试验牛仅为55.0%,低于2.0μg/mL的试验牛为20.0%.反刍动物体内不能合成α-生育酚,必须依赖于饲料中补给,不同牧场奶牛血液中维生素E浓度差异与其所采食的饲粮类型有关,维生素E浓度随日粮中青贮料所占比例的变化而变化[19],新鲜的青草其维生素E含量丰富,但会随着储藏时间的延长而显著降低[11].奶牛需要额外补充的维生素E根据需求量的不同而不同,但也与牛场的管理系统、产奶量和传染病有关[20].关于提高血液中维生素E浓度可以抵抗乳腺炎和提高奶牛的生殖功能是有争议的[18],一些研究者得出提高血液中的维生素E浓度可减少乳腺炎的发生频率[8,21-22],且维生素 E 的摄入量与临床型乳房炎的发生速率呈负相关的结论,LeBlanc等[23]研究得出奶牛日粮中补充维生素E能降低临床型乳房炎的发病率,并缩短临床症状持续时间.但是也有一些研究者并未得出维生素E与乳腺炎间的关系[24-26].Atroshi等[27]在对 20头健康奶牛和 21头患有乳腺炎的奶牛进行对比研究后发现,患有乳腺炎的奶牛其SCC显著升高(P<0.01),血清中维生素E浓度比健康奶牛低(P<0.05).当奶牛SCC高于283 000个/mL则表明患有乳腺炎[28-29],奶牛临床乳房炎阀值为600 000个/mL[30],Weiss等[17]研究得出奶牛血清中维生素E浓度与SCC间不存在相关性,而本试验得出血液中的维生素E浓度与牛奶中体细胞数呈负相关,也就表明血液中维生素浓度越低,患乳腺炎的几率也就越大.Braun等[21]发现高SCC奶牛血液中维生素E浓度与低SCC奶牛血液中维生素E浓度间没有差异,而本试验虽然得出低体细胞数奶牛血液中维生素E浓度高于高体细胞数奶牛,但是差异不显著.在分娩前后,维生素A有抵御乳腺炎等疾病的功能.摄入足够量的维生素A可以保证上皮细胞的正常功能,因此可以提高乳腺对疾病的抵御能力[7].LeBlanc等[22]研究得出分娩前后1周,奶牛血清中维生素A增加100ng/mL,则奶牛在泌乳早期患乳腺炎的几率就会减少60%.Jukola等[31]研究发现维生素A与SCC弱相关(r=0.22),本试验得出维生素A与体细胞数不存在相关性(r<0.2),与Erskine等[32],Oldham 等[4]的结论一致.参考文献[1]Bendich A.Antioxidant,immune response,and animal function [J].J Dairy Sci,1993,76:2789-2794[2]Chew B P,Johnston L A.Effects of supplemental vitamin A andβ-carotene on mastitis in dairy cows[J].J Dairy Sci,1985,68(Suppl 1):191[3]Lotthammer K.Importance ofβ-carotene for the fertility of dairy cattle[J].Feedstuffs,1979,51:34-36[4]Oldham E R,Eberhart R J,Muller L D.Effects of supplemental vitamin A orβ-carotene during the dry period and early lactation on udder health[J].J Dairy 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为此本文主要以生乳标准变化引出对中国奶业标准现状的分析,提出奶业标准存在的问题并运用博弈论模型分析奶业标准涉及的各方利益较量,最后针对奶业标准改进给出意见建议。
关键字:奶业标准、博弈模型、奶业发展一、引言日前,在牛奶行业举办的内部研讨会上,广州市奶业协会理事长王丁棉直斥中国牛奶标准“全球最差”,“是世界乳业之耻”!自三聚氰胺事件之后,奶业标准混乱之弊屡被提及,中国牛奶消费信心至今未愈。
奶牛的乳腺炎和牛奶中体细胞数的关系
乳腺炎和隐性乳腺炎对患牛的奶产量和质量有极大影响。
可引发乳腺炎的病原菌有百余种,但90%~95%由金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和大肠杆菌等感染引起。
隐性乳腺炎对牛奶成分的影响为:乳糖比原成分降低5%~20%,酪蛋白降低6%~18%,乳脂和总固体分别降低5%~12%和3%~12%,钙、磷、钾含量也降低,奶中乳清蛋白增加约占总蛋白量的 1.4%,免疫球蛋白、脂酶等含量有所增高,牛奶的热稳定性下降。
牛奶中的体细胞主要来自血液的白细胞(旧称白血球),小部分为乳腺组织的脱落上皮细胞,后者约占总细胞数的0~7%(也有人报道可多达25%)。
当乳腺组织受细菌感染时,通过机体的免疫系统,白细胞在此处积聚,该乳区分泌的乳汁中,体细胞数随即增多,奶中的体细胞可用专门的体细胞荧光显微自动测定仪迅速测定,目前公认该技术正确性甚高,已被广泛应用。
我们可以根据牛奶中的体细胞数(Somatic Cell Count,简写SCC)来判断乳腺被细菌感染的程度,它可直接反映牛群乳房的健康度,亦可反映损失多少奶量及牛奶质量的好坏。
当今美国的牛奶质量以总乳样体细胞数(大贮缸奶体细胞数bulktandsomaticcellcount,简写BTSCC)为衡量指标,近年来美国、法国、德国、瑞典、荷兰和英国等国在此领域内展开了许多研究。
朱仙玉(山西,太原,华诚睿光(中国)生物科技有限公司)乳房炎是病原性细菌穿过乳头,侵害乳腺引起的炎症。
乳房炎可分为临床性乳房炎和隐性房炎,临床性乳房炎致使乳房红肿、疼痛发热、奶量聚减,挤出絮状奶,牛也会出现发烧、拒食等症状;隐性乳房炎没有临床症状,但奶量降低,它对牛群的危害甚至超过临床性乳房炎,因为它不易引起人们的注意而暗中为害,多数奶牛饲养者天天与它打交道,但仍没有完全认识到其重要性。
据统计,97%的乳房炎属于隐性乳房炎,并能在一定条件下转发为临床性乳房炎。
1. 乳房炎控制目标1.1 奶缸体细胞数≤20万/ml,一胎母牛(产犊时)小于10万/ml,全部母牛85%以上小于20万/ml,全部母牛95%以上小于50万/ml。
1.2 临床乳房炎发病率≤3%;隐形乳房乳房炎感染率≤17%;每年因乳房炎死淘率≤3%。
2 .乳房炎常规检测方法2.1 如果牧场里没有完善的乳房炎记录,也不进行乳房炎检测,就没有可靠的数据来分析牛群的乳房炎感染程度,也就不能解决好乳房炎问题。
2.2 乳房炎的检测方法:2.2.1 挤奶前头3把奶检查2.2.2 牛奶体细胞计数(SCC法)2.2.3 加利福尼亚乳房炎测定法(CMT)2.2.4 实验室细菌培养。
(略)3 .挤奶前头3把奶检查3. 1 把每个乳区的牛奶挤到奶样杯内或挤到挤奶厅地面上检查。
3. 2这种方法只是检查临床乳房炎。
临床乳房炎奶特点是:牛奶颜色不正常,有可见的凝块或絮片,乳房出现红肿热疼。
3. 3发现临床乳房炎立即隔离处理。
注意卫生问题。
4 牛奶体细胞计数4.1 检测体细胞的作用:用于检测牛群隐形乳房炎的感染率和估计每头奶牛感染的严重程度和经济损失4.2 体细胞计数与产奶量的关系4.2.1 每毫升体细胞超过5万时,线性评分每增加一个单位每日产奶量就损失0.68千克。
或每个分值使体细胞计数增加一倍。
例如,体细胞计数每毫升从20万增加到40万,产奶量每头日损失就从1.36千克增加到2.04千克。