水中汞离子(Ⅱ)的纳米生物传感器检测法

主堡堑垄里！里！￡堑垄查垫！！生！旦箜！！堂篁！塑！！也』！趔盟瑾堡！唑Ｑ喳出兰：：ｉ！：坠：！水中汞离子（Ⅱ）的纳米生物传感器检测法吴文鹤洪，Ｊ、兰项序武姚小艳泮婷婷熊隽吕建新

·监测与检验技术·

【摘要１目的运用汞离子特异性寡核营酸探针和纳米金，构建一种能快速比色检测水中Ｈｆ＋的纳米生物传感器。方法对已有的汞离子特异性核行酸探针进行优化设计，并吸附刨纳米金颗粒表面，实现生物传感器的组装。利用汞离子特异性稳定Ｔ．Ｔ错配和纳米金颗粒在高盐条件下的颜色变化，从而实现对Ｈ矿的定量分析。结果制备的纳米金粒径为１５ｎｍ．浓度为２．９７ｎｍｎｌ／Ｌ；成功获得２条截短的汞离子特异性核苷酸探针（９ｂｐ）；构建的汞离子纳米生物传感器．最佳盐浓度为Ｏ．５ｍｏｌ／Ｌ．检测Ｈ矿仅需数分钟，检｝Ｈ限为１０Ｉ．Ｌｍｏｌ／Ｌ，特异性为１００％。结论本研究构建的纳米生物传感器，不需要标记探针或者修饰纳米金，在不使用任何特殊条件下就可以实现对汞离子可视化便捷分析，具有操作简便、检测时间短．灵敏度较高、特异性强等优点，易于推，“使用。【关键词】汞；特异性寡核苷酸探针；纳米生物传感器

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Ｘｎ－ｗｕ，ＹＡ０Ｘｉｏｙａｎ，ＰＡＮＴｉｎ—ｔｉｎ，ＸｉＯＮＧＪｕｎ，ＬＵＪｉａｎ－ｘｉｎ．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏ，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍｉｎ诂ｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ＾如拙ｉ耽，ＷｅｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌ

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Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ：ＬＵｊｉａｎ－ｘｉｎ（Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｘｌｕ３１３＠１６３．ｃｏｍ）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｒａｐｉｄｃｏｌｏｆｉｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｎｇＭＰ＂ｕｒｙ（ＩＩ）Ｉｏｎｓ（Ｈ矿＋）ｉｎｗａｔｅｒｂｙｍｅｒｃｕｒｙ－ｓｐ”ｉｆｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＭＳＯｓ）ｐｒｏｂｅａｎｄｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ

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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｅｒｃｕｒｙ；Ｎａｎｏｂｉｏｓｅｆｌｓｏｒ

汞离子的检测长期以来一直受到研究人员的高度关注。由于汞在生产生活广泛使用，环境中的汞含量不断增长，扩大了汞污染范围。据统计，汞存全球水体中的含量比数年前已增加了３倍．丁业区附近汞含量则董高。由于汞污染具有高迁移性和持久性．可通过甲基化、生物富集以及食物链放大作用。对环境以及人类健康造成极大的危害川。传统的汞离子检测方法包括原子吸收光谱、质谱法等，往往需要大型仪Ｄ０１：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１．９３９１．２０１２．０７．０２２基金项一：国家自然科学基金项同（８１１０１１４８）；浙汀省科技计划面上科研项目１２００９Ｃ３３０３６）；浙江省自然科学基金项目（Ｙ２０８１０７２）：温州市科技计划重大项目（Ｙ２００８００８０）；温州医学院２０１１年学生科研苞顼课毯Ｃｔｗｙｘ２０１｜０１０３３）；温州ｌ｛ｉ科技计划项目（Ｙ２０１１００２１）作者单位：３２５０３５温州医学院检验医学教育部霞点实验室，浙托省医学遗ｆ擘警重点实验室通讯作者：｛ｊ建新．Ｅ．ｍａｉｌ：ｉｘｌｕ３１３＠１６３．ｃｏｌｎ器。成本高、操作复杂耗时，且需要熟练人员操作闭。近年来。国内外已发展了许多汞离子检测方法．其中利用汞离子可使胸腺嘧啶（ｔｈｙｍｉｎｅ，Ｔ）之『ＨＪ形成特异的错配结合（Ｔ－Ｈｆ＋－Ｔ）这一特性构建的一系列纳米金方法尤为突出。２００７年初．Ｍｉｒｋｉｎ课题组阱没计了两段寡核苷酸探针。序列分别为５’Ｈｓ．Ｃ，Ａ，，■Ａ，０３’和５’ＨＳ．Ｃ１０－Ｔ，，Ｔ－Ｔ，０３’。丽当溶液中有Ｈ矛＋存在时，Ｔ－Ｔ错西ａ之间因Ｈ矿ｆ｝ｌｉ彤成特异的键合，使得两探针之问的Ｔｍ值明显升高，从而定量分析Ｈ矿。但该方法需要严格的温度控制，不易于推广使用。Ｘｕｅ等【４嗵过改良组装到纳米金表面的寡核苷酸探针。并引入了第ｉ段序列ｌｉｎｋｅｒＤＮＡ，

使ｌｉｎｋｅｒＤＮＡ篚与２个探针序列同时杂交。该检测方法在室温Ｆ即日ｆ进行旭需要３条寡核瞽酸探针。其中２条仍需要

经过巯基修饰．繁琐耗时且价格昂贵。Ｗａｎｇ等ＩＳｌ报道利用一条聚Ｔ寡核苷酸探针．通过Ｈ矿＋特异性稳定’ｒ．Ｔ错配形成茎环结构，使与聚Ｔ寡核骨酸探针结合的纳米金失去保护而在

万方数据生堡董麴里垒里！些丛茎查垫！！笙！旦里垫鲞笙！塑！！也』！型丛强堡型ｅＱｉ！！』：垫：塑！：！高盐条件下聚集。并产牛红色一蓝色的颜色变化。实现对Ｈｇ＋的快速便捷分析．但灵敏度有待提高。因此．我们继续优化探针设计。通过试验建立了可在水相中自接测定Ｈ一＋的纳米生物传感器法．其操作步骤更简便。寡核苷酸探针序列更短、无需标记．且灵敏度高、特异性好。一、材料与方法１．原理：对已有的汞离子寡核苷酸探针（ｍｅｒｃｕｒｙ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ＭＳＯ）进行优化设计．并通过范德华力吸附到纳米金表面．实现纳米生物传感器的组装。如果溶液巾不存在汞离子．在高盐条件下，ＭＳＯ可以稳定溶液中的纳米金而不会发生聚集；如果溶液中存在汞离子，ＭＳＯ与汞离子特异性结合所形成的稳定的Ｔ－Ｈ９２＂－Ｔ配位化合物（类似双链的结构）。从而冈静电斥力不能吸附到纳米金颗粒表面，导致纳米金颗粒相互聚集．表面等离子吸收峰发生红移，通过颜色变化和Ａ。以。改变即可定性或定量检测溶液中的汞离子。２．仪器：ＶａｒｉｏｓｋａｎＦｌａｓｈ多功能读数仪（美围ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）．透射电子显微镜Ｈ．７５００（日本日立株式会社），加热磁力搅拌器ＤＦ．１０１Ｓ（巩义予华仪器公司），紫外．可见光光谱分光光度计Ｕ－３０１０（日本日立株式会社），５４１７Ｒ小型台式高速冷冻离心机（德围Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ公司），ＰＵＲＥＬＡＢＣｌａｓｓｉｃ超纯水仪（英国ＥＬＧＡＬａｂＷａｔｅｒ公司）。３．试剂：（１）Ｈｇ（Ｎ０３）２标准溶液（１．０ｍｏＬ／Ｌ）：取１６．６８ｇ的Ｈｇ（Ｎ０３）２·１／２Ｈ２０用０．５％ＨＮ０３定容至５０ｍＩ容昔瓶中，保存至棕色瓶。临用前用水稀释至所需浓度。（２）３条ＭＳＯ均由上海柏业贸易有限公司合成。（３）柠檬酸三钠·３Ｈ２０：９９．Ｏ％（上海生丁生物丁程有限公司）。（４）ＨＡｕＣｈ·４Ｈ：Ｏ，Ａｕ含量＞４７．８％（国药集团化学试剂有限公司）。其他所用试剂均为国产分析纯。４．纳米金制备与表征：采用柠檬酸钠还原氯会酸法１６１．将１００ｍｌ０．０１％的氯金酸水溶液加热至剧烈沸腾后．剧烈搅拌下快速加入３．５ｍｌ的Ｉ％柠檬酸三钠溶液．加热搅拌２０ｍｉｎ后停止加热。继续搅拌３０ｍｉｎ后静置，室温自然冷却。用０．２２斗ｍ滤膜过滤。４℃保存。利用透射电子显微镜对纳米金的粒径和形状进行表征。采用紫外一可见光光谱分光光度计对纳米金进行４００～８００ｎｍ波长范围的扫描．表征样品的特征吸收光谱。５．ＭＳＯ优化设计：本次研究选用的ＭＳＯ序列见表１．其中ＭＳＯ。为Ｗａｎｇ等【ｓ暇道的汞离子特异性寡核苷酸探钊（茎环结构）。为了能够提高汞离子检测的灵敏度．并降低ＤＮＡ的合成成本，对ＭＳＯ。进行优化设计，去除非特异的环部分（４ｂｐ），截取两端的茎部分（９ｂＰ），分别标记为ＭＳＯ：和ＭＳＯ。分别取３．５山ＭＳＯ（１０ｐｍｏｌ／ＬＭＳＯｌ，２０ｗｍｏｌ／ＬＭＳ０２、２０ｐｍｏｌ／ＬＭＳ０３或者ＭＳ０２和ＭＳＯ，各１０ｐ．ｍｏｌ／Ｌ混合液），加入３．５ⅢＨ矿（１００ｐ．ｍｏｉ／Ｌ）用超纯水补充至总体积２０一，室温反应５ｒａｉｎ，然后加入１００“ｌ纳米金，摩温反应５ｒａｉｎ．最后加入ｌ３一ＮａＮ０３。观察颜色变化，并用ＶａｒｉｏｓｋａｎＦｌａｓｈ多功能酶标仪记录每孔的，４。和Ａ。，同时每组都以超纯水做空白对照，计算不Ｉ司ＭＳＯ检测Ｈ矿的信噪比（洲）。表ｌ汞离子特异性寡核苷酸（ＭＳＯ）序列５３７６．ＮａＮＯ，浓度优化：分别取１３“ｌ不同浓度（０．２５、０．５０、１．００、２．００ｍｏｌ／ｋ）的ＮａＮＯ，．用上述优化设计的ＭＳＯ进行比色检测，用ＶａｒｉｏｓｋａｎＦｌａｓｈ多功能酶标仪｝己录每孔的Ａ∞和＾。，同时每组都以超纯水做空白对照，计算不同ＮａＮＯ，浓度下检测Ｈ矿的Ｓ／Ｎ。７．比色检测Ｈ矿：分别取３．５叫不同的待检测水溶液，用上述优化的条件进行比色检测Ｈｆ＋。选择Ｈ矿＋浓度为０、ｌＯ、２０、５０、１００、１５０、２００和１０００ｌａ，ｍ０１．／Ｌ对汞离子纳米生物传感器的灵敏度进行评价。选择Ｋ＋、Ｎａ＋、“＋、ｃａ“、Ｍ，＋、Ｂａ“、Ｃｕ“、ｚｎ“、Ｃｄ：＋和Ｈ９２埘汞离子纳米生物传感器的特异性进