急性低氧条件下复氧后大鼠脑HIF-1α、nNOS蛋白的表达与人参皂甙Rd干预
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论著急性低氧条件下复氧后大鼠脑H I F1、n NOS蛋白的表达与人参皂甙Rd干预田飞杨金升石向群陈杰妮魏海萍格日力摘要目的观察大鼠脑缺氧状态下缺氧诱导因子1(H I F1)、神经元性一氧化氮合酶(n NOS)蛋白的表达规律及低氧状态下人参皂甙R d(Rd)干预对其影响并探讨机理。
方法将成年W i star大鼠120只随机分为3组:急性低氧组(对照组);低氧预处理组(低氧干预组);人参皂甙Rd预处理组(药物干预组)。
每组按照缺氧后不同时间点再分为4个亚组,各亚组10只大鼠,分别观察各组大鼠海马锥体细胞层神经元形态的变化及H I F1、nNOS蛋白的表达规律。
结果在缺氧后复氧即刻,我们可以发现H IF1、n NOS蛋白的少量表达,主要存在于海马细胞,多在细胞质中表达;随着时间的推移,在复氧后4h,H IF1、nNOS表达渐达高峰,至复氧后9h H IF1表达明显减少,而nNOS表达至复氧后24h明显减少。
低氧预处理组及人参皂甙Rd预处理组的实验结果发现H I F1、nNOS表达较对照组减少,与急性低氧组各时间点相比,均有统计学意义(P=0.009)。
两个干预组之间各时间点比较无统计学差异(P>0.05)。
结论急性低氧可以促使H IF1、n NOS蛋白在大鼠海马神经细胞的表达,具有时间依赖性;同时低氧预处理及人参皂甙Rd预处理均可促使大鼠脑组织H I F1、nN OS表达减少,可能对急性缺氧性脑损伤产生保护作用,其具体机理可能与其抗自由基、抑制C a2+内流有关关键词脑缺氧后复氧;缺氧诱导因子1;神经元性一氧化氮合酶;人参皂甙Rd;海马中图分类号:R741文献标识码:A文章编号:1006351X(2011)02012404The exp r essi on of H IF1,nNO S a fter a cu te cer eb ra l hypoxia r eoxygen in ra ts and gin senoside R d in ter ference study TI A N F ei,Y A NG J in s heng,S H I Xiang qun,CHEN J ie ni,W EI H a i pi ng,G E R i li.Depa rt m ent ofNeurolo gy,Lanzho u Genera lH osp ital of Lanzhou M ili tary Co mm and,Gansu730050China.C or r espond i ng au thor:Y ANG Ji n sheng,Em a i:l yangji nsh@163.co mAb stra ct O bjective To observe t he ex press i on ofH IF1、n NOS in cerebra l hypo xia rats and the e ffect bygi nsenosi de R d i nterference as we ll as t o exp l ore its possible m echanis m.M ethod s120adu lt wistar rats wered i vi ded i nto3gro ups:acute hypo xia group hypo xia pretreat m ent gro up gi nsenos i de R d i nterfe rence gro up;eachgroup is d i vi ded i nto4sub groups(10rats pe r sub gro up)as different hypoxic ti m e,t o observe the change ofh i ppoca m pus ce lls'shape and the expressi on of H I F1、n NOS i n every group.R esults At i m m ediate reo xygenti m e,we can found a few expressi on of H IF1、n NOS prote i n wh ich m ostl y consi sted i n h i ppoca m pus ce l,l m uch ofthem i n cytoplas m;as ti m e processed,t he leve l ofH I F1、nNOS gat hered the peak at reoxygen4h;the leve l ofH IF1m arked l y dec reased a t reoxygen9h;and the level of nNOS m arkedly decreased at reo xygen24h.There i ssta ti sti ca l d iffe rences for AOD va l ues bet ween control groups and i n terference groups at every ti m e spot(P=0.009).There i s no sta ti sti ca l d ifferences be t w een t wo i n terference groups at every ti m e spot(P>0.05)C on clusi on Acu tehy poxi a can cause the expressi on ofH IF1、nNOS i n rat hippoca mpus cells and its expressio n has ti m e dependence;at the sam e ti m e,hypoxi a pre trea t m ent and ginsenosi de Rd interference can m ake t he expressio n of H I F1、n NOSdecreased;i t suggests tha t these pre trea t m en tm easures may have protective acti on for acu te hypoxi a cerebra l i njury,the regulati on of Ca2+i nfl ux and the i nh i b iti on of oxy gen free radicals m ay be one of its m echanis m.K ey wor ds Cerebra l hy poxi a reoxy genati on;H IF1;n NOS;G i nsenos i de R d;H i ppoca m pus作者单位35甘肃,兰州军区总医院神经内科(田飞、杨金升、石向群、陈杰妮、魏海萍);青海大学医学院高原医学研究中心(格日力)通信作者杨金升,y j@63缺氧是造成细胞损伤的最常见原因之一,可以诱发体内各系统的功能改变,尤其对于中枢神经系统,常引起不可逆的中枢神经系统损伤,其在神经系统疾病:7000:Em ai:l ang i nsh1.co m的发生发展过程中起着重要的作用,可以激活脑内一系列应答适应反应,例如缺氧诱导因子1(hy poxia i nduc i b le f actor1,H I F1)、神经元性一氧化氮合酶(neurona l nitric o xide sy nthase,n NOS)、血管内皮细胞生长因子(v ascular endot he lia l gro wth f actor,VEGF)等的表达,来减轻缺氧损伤。
有研究表明n NOS对于缺氧的应答可能来自于其对H I F1的应答[1]。
本研究应用低氧预处理及人参皂甙Rd预处理对急性低氧进行干预,旨在探讨急性缺氧后复氧状态下,大鼠脑H I F1、n NOS的表达规律,为研究低氧状态下的神经保护及相关缺氧缺血疾病的发病机理及治疗提供依据。
材料与方法一、实验动物与试剂雄性W i star大鼠120只,体质量250~320克,由兰州大学医学院实验动物中心提供。
兔多克隆抗体H I F1、n NOS,即用型S ABC试剂盒、D AB显色试剂均购于武汉博士德生物工程公司。
采用随机数字表法将实验动物分为6%氧浓度组、15%氧浓度预处理组、人参皂甙Rd预处理组,根据缺氧后复氧时间每组再分为复氧后0h、4h、9h、24h四个亚组,每个亚组10只大鼠。
二、试验方法1.低氧舱制备将大鼠由兰州大学医学院实验动物中心(海拔1500米)运送至青海大学医学院高原医学研究中心(海拔2200米),22~25环境中饲养5 ~7d,造模前夜禁食,自由进水。
大鼠低氧舱由青海大学医学院高原医学研究中心提供,用大小十块有机玻璃制作低氧舱,舱体长50c m,宽40c m,高30c m,面与面之间连接处密封,正面壁开置2个直径约0.3c m的小孔,分别连接Bio pac16导生理信号采集系统监测仪(监测低氧舱内氧浓度)及6%或15%氧气罐,舱底放入钠石灰吸收大鼠呼出的C O2气体,避免CO2浓度升高,影响实验结果。
舱体窄侧壁两面小窗口有活动闸门与外界空气相通,使舱内气压与大气压相平衡,以保证舱内氧浓度、气体流量及CO2浓度恒定,达到符合实验要求的低氧浓度。
2.试验步骤6%氧浓度组20只大鼠放入低氧舱,将氧浓度由室内自然状态下21%在0.5h内降至6%,持续后将大鼠取出,分批次复氧四个时间点麻醉取材,水合氯醛(L K)腹腔注射麻醉,开胸暴露心脏,经心脏快速灌注冰生理盐水5L后,%多聚甲醛(,)5L继续灌注固定后,断头取脑,将脑组织浸泡于多聚甲醛固定液中6~8h,取视交叉后1~4mm脑块进行石蜡包埋,冠状面切片,片厚4m。
15%氧浓度预处理组20只大鼠放入低氧舱,将氧浓度由21%降至15%后持续1h,之后再将氧浓度在0.5h内下降至6%持续2h,灌注固定取材步骤同前。
人参皂甙Rd预处理组20只大鼠,人参皂甙Rd 稀释成相当浓度腹腔注射一周(30mg/Kg),将大鼠放入低氧舱,氧浓度由21%在0.5h内降至6%,持续2h 后取出,灌注固定取材步骤同前。
3、受试大鼠海马区细胞形态学变化及H I F1、n NOS表达变化研究采用免疫组化S ABC法进行染色,每个标本取两张石蜡切片,脱蜡至水,微波热修复, PBS液漂洗;3%H2O2室温孵育10m in;PBS液漂洗; 5%BS A液封闭,室温孵育20m i n;分别滴加H I F1、n NOS兔多克隆抗体(1:50稀释)4孵育过夜;PBS液漂洗;滴加生物素化标记羊抗兔二抗,室温孵育30m i n;PBS液漂洗,滴加S ABC,3720m in,PBS液漂洗;DAB显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,封片。
