乙型肝炎病毒耐药及监测

乙型肝炎病毒耐药及监测

张欣欣　于德敏

作者单位5　上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科 目前国内外批准上市的慢性乙型肝炎治疗药物有

6种:普通干扰素、聚乙二醇干扰素、拉米夫定、阿德福

韦、恩替卡韦和替比夫定。治疗应答包括血清HBV

DNA的阴转、ALT的正常化、HBeAg的血清学转换和肝

组织学的改善。然而随着核苷(酸)类药物治疗时间的

延长,乙肝病毒的耐药株有可能被筛选出来,并因此导

致HBVDNA水平的再次升高(病毒突破)、ALT的反弹

和HBeAg血清学转换的逆转,已成为影响抗病毒疗效

的主要因素而受到广泛关注。

一、抗病毒治疗失败的定义

抗病毒治疗失败可分为原发性治疗失败和继发性

治疗失败[1]。原发性治疗失败指抗病毒治疗6个月后

病毒载量的下降<1log10IUΠmL。继发性治疗失败是

指在开始治疗有效(HBVDNA下降≥1log10IUΠmL)

后,病毒复制的反弹≥1log10IUΠmL。病毒反弹应当

至少重复1次,每次间隔至少1个月的HBVDNA定量

检测来确定,但如果同时伴随着ALT的升高则例外。

HBVDNA检查方法的敏感性决定了确诊的时间,因此

要早期诊断治疗失败必须要有高灵敏度和高特异性的

检查方法。

对用干扰素治疗的病人,考虑到药物作用的机制,

抗病毒治疗失败需要进一步的定义。α干扰素治疗失

败是指在6个月时HBVDNA下降<1log10IUΠmL或

病毒载量>109IUΠmL。

目前各种临床试验对治疗失败的定义不尽相同。

可有检测HBVDNA方法不同,耐药基因型检测和表型

检测方法多样性,检测HBVDNA所采用时间点差异

等。因此,为避免这些不一致性,治疗病人应当使用同

一种实验室检查方法进行监测,并且病毒载量应当使

用国际单位来计算。

二、HBV准种动力学变化和耐药的产生

乙肝病毒的复制是通过逆转录方式进行的,在这

个阶段病毒逆转录酶的自发出错率可导致点突变的累

加。病毒准种的进化依赖着选择压力(例如抗病毒药

物和免疫应答引起的压力)、变异导致的复制适应性以及是否有未感染的肝细胞为具有更强适应性的变异株

(如逃避变异株)提供复制空间。

乙肝患者体内HBV是以准种形式存在的,不同的

病毒准种具有不同的生物学特性,比如不同的药物敏

感性等。这些耐药变异株可能在感染时就存在,也可

能在慢性感染过程中发生,在治疗过程中如果病毒滴

度足够高也可出现,但更为少见。在没有药物压力的

情况下,耐药变异株的复制能力往往低于野毒株,因此

治疗开始时,肝细胞大部分被野毒株所感染,只有一小

部分细胞内存在着耐药变异株。使用抗病毒药物后宿

主体内环境发生了改变,这时变异株的复制适应性超

过了野毒株,选择压力对变异株更有利。一段时间以

后,野毒株感染的肝细胞以细胞更新的方式被清除,并

取代以未感染的细胞,这种未感染的细胞很容易被此

时具有复制优势的耐药变异株所感染。当有足够的细

胞被耐药变异株感染后,在血清中就可以观察到HBV

DNA的上升。变异株成为优势株的速度取决于病毒

自身的复制适应性和被感染肝细胞的更新速度。[2-5]

ALT水平可以作为肝细胞裂解和随后细胞更新的间接

标志。停药后准种情况又可发生改变,因为野毒株又

重新获得了优于耐药变异株的复制适应性而成为优势

株。

值得注意的是尽管目前的治疗药物可以显著地抑

制病毒,但病毒仍然保持了相对较高的复制水平。在

治疗前就存在的变异株很有可能会出现更多的变异,

这一点同HIV感染的治疗情况不同,后者联用3种抗

病毒药物将病毒抑制到非常低的水平后,病毒发生新

变异的可能性非常小。此外,同时具有代偿性变异的

耐药株的复制能力可强于野毒株[1]。

三、HBV耐药的预测因素

病毒耐药的预测因素可分为治疗前和治疗期间二

大类。一项法国的多中心队列研究评估了拉米夫定耐

药的预测因素[6],在单变量分析中,拉米夫定耐药的治

疗前预测因素包括Metavir纤维化分值≥3、HBVDNA

>5×6IUΠL、高酒精摄入和年龄>5岁。在多变

量分析中,治疗前病毒载量是与YMDD变异相关的唯

一参数(比值5;5%可信区间35)。52肝脏2007年9月第12卷增刊

:2000210m0

odds:1.99:1.07-.0

发生YMDD变异的患者治疗前平均病毒载量是9.8×

106IUΠmL,未变异组为7.7×106IUΠmL。

核苷(酸)类似物治疗期间,病毒载量较低的患者

发生耐药变异的风险也较低。一项研究发现,在拉米

夫定治疗6个月时HBVDNA<103IUΠmL的患者发生

耐药变异的大约为8%,而在同一时间点HBVDNA>

103IUΠmL的患者发生率是64%[7.8]。另外,阿德福韦

治疗12个月后的患者HBVDNA≥103IUΠmL是治疗

第三年发生变异的良好预测因素[9]。对于恩替卡韦治

疗的病人,有关病毒载量与耐药风险的相关性研究的

资料目前还很有限。

四、HBV耐药的监测

在确诊原发性和继发性耐药之前,需要排除一些

非病毒相关因素,如治疗的非依从性和药物代谢转化

的影响。对于依从性可以通过测定药物浓度来评价,

不过目前国内还没有开展这方面的工作。

HBV耐药的动力学变化在以拉米夫定治疗的过

程中可以很清楚地观察到。在拉米夫定开始治疗时,

可观察到HBVDNA的下降,接着病人进入一个病毒被

抑制到最低程度的维持阶段,这个阶段是临床治疗的

关键。这时用灵敏的检测方法可以较早的在HBV

DNA上升之前检测到耐药株。通过早期检测变异株,

可以尽早的改变治疗方法以避免HBVDNA的上升和

可能的肝病恶化[3,6],但这些方法很难用于临床检测。

HBVDNA的载量检测

在临床医疗中应用抗病毒药物所采用的耐药监测

方法与临床试验是一样的。诊断原发性或继发性治疗

失败的第一步是利用高灵敏度的方法检查HBVDNA。

核苷(酸)类似物的作用是抑制HBVDNA的生成和感

染性病毒颗粒的产生,因此检测血清中的HBVDNA可

以了解这类药物对于病毒产生的影响。由于病毒复制

的控制和抗病毒治疗效果(如HBeAg血清学转换、组

织学应答和降低包括肝细胞癌在内的并发症发病率)

之间存在着明显的相关性,病毒载量在决定疗效方面

具有重要意义。在治疗期间将病毒复制抑制到非常低

或无法检测到的水平是防止病毒反跳和以后慢性乙型

肝炎病情进展的关键[11]。

被乙肝病毒感染的肝脏会产生大量的病毒颗粒入

血。抗病毒药物通过抑制病毒在肝脏中的复制而降低

血清中的病毒载量。即使用敏感的检查方法也无法检

测到血清中的病毒时,在感染的肝细胞内仍然存在着

共价闭合环状DN(DN)。BVDN是非常稳

定的,它从宿主体内清除的速度要比血清中BVDN

慢的多,甚至在发生B血清学转换后,DN仍然可能存在。因此那些在HBVDNA得到抑制后还维

持治疗的患者仍然需要灵敏的检查方法以监测治疗疗

效[12,13]。

目前国内外有许多商售的HBVDNA检测试剂,其

检测的灵敏度及范围相差很大。要获得抗病毒疗效最

准确的评价和观察患者病毒载量的动力学改变,用以

监测DNA的检查方法既要有较低的检测下限,又要有

较大的检测范围。这样可以使医生观察到药物在患者

体内作用的速度和强度,而且可以及时地发现病毒突

破并采取干预措施。此外,同一份样本经两个不同的

检测方法检测,得出的结果可相差>1log10IUΠmL[14]。

因此,在临床医疗和临床试验中,每个病人都应当始终

使用同一种检测方法。然而这在需要进行长期随访和

具有远期治疗终点的临床试验中可能是困难的,因为

在评价治疗阶段检测方法会经常改变[15]。

HBV基因变异检测

要确定治疗过程中出现的变异株,应当采用常规

的直接测序或一种基因型检测方法,比如线探针杂交

法、实时荧光PCR方法、限制性片段长度多态性

(RFLP)、基因芯片等。如果测序确定了一个或多个与

目前治疗耐药相关的已知变异位点的存在,HBV耐药

可以确诊。在这时可以考虑改变治疗、停止治疗或加

用其它药物。然而,如果测序发现了新的变异位点,而

它与病毒耐药的关系并不明确,那么还需要做更多特

性研究。表型分析有助于观察未知变异株的动力学特

性。有些变异可能与表型敏感性下降有关,但还没有

达到导致治疗失败的程度[15]。

确定一个新的耐药变异,PCR产物测序方法要优

于线性探针技术等其它方法[16,17]。测序方法扩增患者

血清样本中的HBVDNA并将产物直接测序,结果与野

毒株序列相对比以确定导致对某种抗病毒药物耐药的

位点替换。线性探针杂交技术是利用固定在尼龙膜上

的DNA探针来快速地检测样本中已知的点突变。

PCR测序技术可以在不了解耐药特点的情况下确定任

何新的变异位点,这在临床试验中可以全面地观察病

毒变化情况。研究表明和直接测序方法相比,线性探

针技术往往可以在更早的时间点检测出已知的变异位

点,在变异株和野毒株同时存在的情况下后者具有更

好的敏感性[18]。线性探针技术现在已经商业化。然

而,在参考临床病毒文库时就要使用PCR测序方法。

表型检测与病毒耐药监测和病毒准种的出现相

关[,3]。采用序贯治疗有可能筛选出对多种药物耐药

的变异株,说明病毒准种的复杂性和病毒聚合酶可以

同时发生多个位点变异的可塑性,因此了解不同抗病62ChineseHepatology,Sep2007,Vol12,Suppl

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