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犬攻毒用狂犬病街毒株BD06的特性

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狂犬病是由狂犬病毒属（Lyssaivrus）成员感染动物中枢神经系统引起的一种人兽共患传染病，临床表现为急性进行性脑脊髓炎，一旦发病，致死率几乎100%［1］。

目前，狂犬病毒属已经发现了15种病毒，但是仅有狂犬病病毒（rabies virus，RABV）在全世界广泛流行，也是造成我国人和动物狂犬病流行的唯一病原［2］。

虽然我国最近发现了蝙蝠狂犬病毒，但尚未明确其流行情况［3］。

RABV不同毒株间存在较强的免疫交叉反应［4］，因此，疫苗是目前预防狂犬病最有效的生物制剂之一。

疫苗效力是反映狂犬病免疫保护水平的最重要指标［5］。

目前，常用的兽用狂犬病疫苗效力测定方法分为三类：基于中和抗体检测的动物免疫试验，如犬攻毒用狂犬病街毒株BD06的特性刘晔，张守峰，潘铁骊，张菲，王颖，连海，张锦霞，扈荣良中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春130122摘要：目的对狂犬病街毒株BD06进行了毒株特异性分析，并评价其对犬的攻毒效果。

方法将BD06株病毒于比格犬脑内传至第10代，参照《中国兽药典》三部（2010版）进行外源病毒（犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、Ⅰ型和Ⅱ型腺病毒）、支原体检测和无菌检验；提取传至第10代的犬脑组织总RNA，进行RT⁃PCR扩增反应，并进行全基因序列测序；经小鼠脑内传代后，测定小鼠的半数致死量（MICLD50）；用2×104、5×104和10×104MICLD50/ml的鼠脑悬液，分别采用后肢肌注法和咬肌注射法进行犬攻毒试验。

结果BD06株病毒在犬脑中传至第10代，无外源病毒、支原体和细菌污染，基因序列未发生变化；经鼠脑传代1次后，MICLD50达105.32/ml；经咬肌注射5×104MICLD50/ml 的BD06株病毒悬液可获得最佳犬攻毒效果。

结论BD06株病毒传代简单，对犬致病性强，可作为我国犬攻毒用狂犬病病毒的候选株。

关键词：狂犬病病毒；犬；攻毒中图分类号：R373.9文献标识码：A文章编号：1004⁃5503（2014）01⁃0033⁃04Characteristics of rabies street virus strain BD06for challenge test in dogsLIU Ye，ZHANG Shou⁃feng，PAN Tie⁃li，ZHANG Fei，WANG Ying，LIAN Hai，ZHANG Jin⁃xia，HU Rong⁃liang Military Veterinary Research Institute，AMMS，Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Preventionand Control，Changchun130122，Jilin Province，ChinaCorresponding author:HU Rong⁃liang，E⁃mail:ronglianghu@Abstract：Objective To analyze the specificity of rabies street virus strain BD06and evaluate its effect in challenge testin dogs.Methods BD06was subcultured to passage10in brains of Beagle dogs，and tested for adventitious agents including foreign viruses such as dog distemper virus，parvovirus，coronavirus as well as adenovirus typesⅠandⅡ，mycoplasma and sterility according to the requirements in Chinese Veterinary Pharmacopoeia（VolumeⅢ，2010edition）. Total RNA was extracted from the brain tissue of dogs，in which the virus was subcultured to passage10，for amplification by RT⁃PCR and sequencing.The virus was subcultured in the brains of mice and determined for MICLD50. Dogs were challenged i.m.with the mouse brain suspensions at dosages of2×104，5×104和10×104MICLD50/ml in behind limbs and masseter separately.Results No foreign viruses，mycoplasma or bacteria were observed in BD06strain after subculture in dog brain to passage10，while the gene sequence showed no change.The MICLD50of the strain after subculture in mouse brain for one passage reached105.32/ml.The challenge test in dogs with the strain at a dosageof5×104MICLD50/ml by injection in masseter showed satisfactory effect.Conclusion Rabies virus strain BD06was simple to be subcultured and highly pathogenic to dogs，which might be used as a candidate for challenge test in dogs.Key words：Rabies virus；Dog；Virus challenge·基础研究·基金项目：国家863计划项目（2011AA10A212）；公益性行业（农业）科研专项资助（201203056）.通讯作者：扈荣良，E⁃mail：ronglianghu@《欧洲药典》推荐的小鼠血清学疫苗效力检测法［6］；体外检测法，如ELISA法和单向免疫扩散法［7⁃8］；攻毒保护试验，如小鼠和犬的免疫保护试验。

其中，小鼠免疫保护试验（WHO推荐的NIH法［9］和《欧洲药典》推荐的单剂量小鼠保护试验［10］）常用于疫苗的效力检测；犬的免疫保护试验则多用于疫苗研究阶段的实验室评价，是疫苗尤其是兽用疫苗研制和注册的必检项目。

目前，我国使用的标准攻击毒仅有小鼠固定株CVS⁃24。

该毒株1986年由中国药品生物制品检定所引进，仅用于小鼠攻毒试验，但对犬的致死率（约30%）较低。

根据国际标准的犬攻毒试验标准，对照犬死亡率应≥80%［11］。

因此，建立1株致死性强的犬用标准攻击毒，是我国狂犬病疫苗发展的迫切需求。

本实验利用分离自犬的狂犬病街毒株BD06，进行了毒株特性分析和犬攻毒试验，建立了犬攻毒用狂犬病病毒侯选株。

1材料与方法1.1毒株狂犬病街毒株BD06由军事兽医研究所流行病学研究室于2006年分离自河北省保定市的1只流浪疯犬脑组织。

1.2实验动物SPF级ICR小鼠，雌性，60只，13~ 16g，购自长春生物制品研究所有限责任公司，动物合格证号：SCXK（吉）2011⁃0003；成年比格犬42只，雌雄随机，5~6kg，购自北京玛斯生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2011⁃0003。

1.3主要试剂一步法RT⁃PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；总RNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司。

1.4外源因子检测将BD06株病毒于比格犬脑内传至第10代，参照《中国兽药典》三部（2010版），分别对传至第1~10代的BD06株病毒进行外源病毒（犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、Ⅰ型和Ⅱ型腺病毒）、支原体检测和无菌检验［11］。

1.5基因全序列测定提取传代至第10代的犬脑组织总RNA，利用病毒传代前全基因组序列（EU⁃549783.1）设计12对相互重叠的特异性引物，引物序列见表1。

参照RT⁃PCR试剂盒说明进行一步扩增反应［12］，扩增产物送金斯瑞生物技术有限公司测序。

1.6小鼠半数致死量（MICLD50）的测定取传至第10代的犬脑组织制成10%匀浆悬液，30μl/只接种鼠脑，待小鼠发病死亡后，取脑组织制成10%匀浆悬液，进行10倍系列稀释至106，脑腔接种小鼠，30μl/只。

每日观察并记录小鼠的临床表现、发病及死亡情况，至注射后21d。

采用直接免疫荧光（direct immunofluorescence assay，DFA）法检测死亡小鼠脑组织［13］，采用Käber法计算MICLD50。

表1全序列扩增引物Tab1.Primers for amplification of full⁃length gene sequences引物引物引物序列产物长度序号名称（5′→3′）（bp）1F1GGTACCACGCTTAACAACAAAAC1100 R1TCTCCCAAATAGCCTCCAAG2F2TTCATCCATTTCCGTTCGC1192 R2TACGGATAAGTCATCTTCTTCATTGGTC3F3CTACTCAGACTGTTGGCAAAGAA1084 R3TCATCCCAGGTGATTTCTTG4F4CGGATTAGTCAAGGTCGTTATT1124 R4GGTTAGTAGAGCAGCAAGTGGAG5F5ACCACTGGCTCCGAACTG1154 R5TGGTCTCACTTCCGCTTTT6F6ATAGAGCAGGGTCAATACAACAC1109 R6TTTCAAGGCAACTCAATACTCC7F7GTATGGAGCCCACTCTGAATC1250 R7CTGGGATTGACAGGTGGC8F8TGGCATAAACTCCCAATCAC1193 R8CATAAGTAGAAAGTCCCTCATCG9F9GAACGACCAGATAGTCAACCTC1294 R9ACCTGGCAGATTTGAACCTAT10F10ATCACAAGAAACTCGAACCTG1149 R10CTAAGGTATCTTCTCCGTGCC11F11CCCCTGAGAATGACTGGTTG1030 R11AGACGAGGTCATCTGGGTTAT12F12GCATCAGTCAATCGGATAACAC1105 R12GACCCACGCTTAACAAATAAAC1.7犬攻毒剂量和攻毒途径的检测制备含BD06株病毒2×104、5×104和10×104MICLD50/ml的鼠脑悬液，采用后肢肌注法和咬肌注射法分别接种18只比格犬，每剂量接种6只，每只接种1ml，以不接种病毒的6只比格犬作阴性对照。

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犬五联抗

犬五联抗

犬五联抗特点：含有高效价同源精制血清抗体，能有效地治疗和预防犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病与犬细小病毒病高免血清，提高犬只免疫力，增强犬只体质。

【商品名】犬五联抗【主要成份】犬同源精制血清抗体【性状】微红色或淡黄色液体，久置有少量沉淀【药理作用】犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病与犬细小病毒病同源精制血清抗体系用犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病与犬细小病毒病病毒浓缩精制疫苗免疫健康犬只，产生高效价抗体后，收集血清，采用酶切、透析、沉淀技术提取IgG Fab片段加保护剂制备而成。

本品注射后可快速被机体吸收（1个小时可达到最高血浓度），与病原体结合后能够迅速中和病毒彻底清除病原体对机体的危害，迅速控制犬只疫情；同时，诱导机体产生内源性干扰素，促进抗体形成，阻止病毒性细胞的复制，从而起到抗感染抗病毒杀菌的作用。

【产品特点】1、含有高效价，犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病与犬细小病毒病效价均大于1：1024。

2、作用迅速，用药后30分钟起效，1小时达到血药高峰，体内维持时间长；3. 具有提高机体的抵抗力，有效降低其他疾病的发生作用；4. 可解毒、镇痛，清除氧化物，清除氧自由基对粘膜的损害，刺激细胞表面活性物质的分泌；5. 采用先进的生物灭活技术，配合0.1微米过滤，杜绝所携外源病原；（绝无野毒感染）6. 使用安全，有7-15天的免疫期，可做紧急预防。

【适应症】本品用于犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病与犬细小病毒病的紧急预防和紧急治疗。

增强免疫力、中和病毒。

提高犬只抗病力，增强犬只体质。

【用法用量】肌肉注射：0.1ml/kg体重，1次/天，连用2天。

预防剂量减半或遵医嘱。

【注意事项】1、本品内加入生物制剂，安全起效快2、不得与酸碱溶液、磺胺类药、地米同时混合注射；3、本品在运输保存时，避免反复冻融。

4、有污染，混浊及变色勿用；5、本品长期使用不会有耐药性产生。

6、偶有个体发生过敏者用0．1﹪肾上腺素缓解。

犬疫苗方案介绍

犬疫苗方案介绍

犬疫苗方案1. 引言犬疫苗是预防犬类传染病的重要手段，有效保护犬只的健康。

本文档将提供一套综合的犬疫苗方案，包括常见犬类传染病的疫苗类型、接种时间和接种建议，以保证犬只的免疫力和健康。

2. 常见犬类传染病及疫苗类型2.1 狂犬病狂犬病是一种致命的病毒性传染病，能够通过受感染动物的唾液传播给其他动物和人类。

因此，对于每只狗来说，狂犬病疫苗是必须接种的。

常用的狂犬病疫苗主要有：•标准狂犬病疫苗（DAP），包含狂犬病病毒株和其他常见犬病的抗原成分；•纯狂犬病疫苗（RAB），只包含狂犬病病毒株的抗原成分。

2.2 犬细小病毒（CDV）犬细小病毒是一种高度传染性的病毒性疾病，主要通过空气飞沫传播。

犬细小病毒感染后可导致呼吸道症状、消化系统症状、神经系统症状等。

犬细小病毒疫苗主要有：•多联疫苗（DHPP），含犬瘟热、犬肠炎、犬病毒性肠炎和犬细小病毒等多种疾病的疫苗；•单一疫苗，只包含犬细小病毒的抗原成分。

2.3 犬肺炎犬肺炎是由多种细菌引起的呼吸系统感染，较为常见的细菌包括肺炎链球菌和犬克雷伯氏菌。

接种犬肺炎疫苗可有效预防此类感染。

常用的犬肺炎疫苗包括：•多联疫苗（DHPP），含犬瘟热、犬肠炎、犬病毒性肠炎和犬肺炎等多种疾病的疫苗；•单一疫苗，只包含犬肺炎细菌的抗原成分。

3. 犬疫苗接种时间和接种建议3.1 幼犬期在狗狗幼年时期，免疫系统较为脆弱，容易受到各种病毒和细菌的侵袭，因此需要及时接种疫苗来建立免疫防线。

常见的幼犬期疫苗接种时间和建议如下：•6-8周龄：接种第一针DHPP多联疫苗；•10-12周龄：接种第二针DHPP多联疫苗；•14-16周龄：接种第三针DHPP多联疫苗。

3.2 成年期在幼犬期接种完基础疫苗后，犬只进入了成年期。

成年犬应每年进行一次犬疫苗接种来维持其免疫力。

常见的成年期疫苗接种建议如下：•每年接种一针DHPP多联疫苗，以保持对犬瘟热、犬肠炎、犬病毒性肠炎和犬细小病毒的免疫；•每三年重新接种一次纯狂犬病疫苗，以保持对狂犬病的免疫。

中国12株狂犬病街毒株G基因序列测定与分析_孟胜利

中国12株狂犬病街毒株G基因序列测定与分析_孟胜利

文章编号:1002-2694(2009)06-0479-05中国12株狂犬病街毒株G 基因序列测定与分析*孟胜利1,徐葛林1,吴 杰1,王定明2,严家新1,杨晓明1摘 要:目的 了解中国狂犬病毒的流行情况以及街毒株与中国人用、兽用狂犬病疫苗株在G 基因核苷酸和氨基酸水平的差异,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。

方法 对12株街毒株G 基因进行了全基因测序,与其它36株中国狂犬病街毒株,以及中国的疫苗株和其它国家毒株的G 基因序列进行了综合分析。

结果 序列分析表明来源于中国的50株狂犬病毒均为基因Ñ型狂犬病毒;其中具有代表性的6株病毒与我国现在使用的各种疫苗株在G 基因的核苷酸和氨基酸水平上均存在不同程度的差异,与我国人用疫苗株CT N 同源性较高;进化分析表明,我国主要流行狂犬病毒与泰国、印度尼西亚、马来西亚等东南亚狂犬病毒株处于同一分支。

中国毒株之间G 基因核苷酸同源性分别\82.3%;氨基酸同源性分别\92.1%;中国街毒株与疫苗株相比较核苷酸的同源性为79.3%~94.2%,氨基酸的同源性为87.8%~97.9%。

结论 我国的狂犬病毒为基因Ñ型狂犬病毒,可以明确分为6个进化群。

无论在核苷酸还是氨基酸水平上,中国多数街毒株与疫苗株CT N 之间的同源性要高于与其它疫苗株。

关键词:狂犬病毒;分子流行病;G 基因;测序分析;中国 中图分类号:R 373.9 文献标识码:ASequencing and analysis of the glycoprotein gene from12Chinese street strains of the rabies virusesM EN G Sheng -li 1,XU Ge -lin 1,WU Jie 1,WANG Ding -m ing 3,YAN Jia -xin 1,YANG Xiao -ming 1(Center of Rabies Diagnosis ,W uhan I nstitute of Biological P ro ducts ,W uhan 430060,China)ABSTRACT:T o under stand the curr ent pr evalence of rabies at China and the differ ence at nucleot ide and amino acid levels of the g ly copro tein g ene (G g ene)o f r abies v accine st rains used fo r human and animals,the G g ene of 12street strains isolated fr om different reg ions of China wer e sequenced and these sequencing data w ere ana lyzed w ith t he G g enes sequence of 36Ch-i nese street v iruses and those o f v accine and some strains isolated fro m o ther co untr ies.T he phylo genic analysis sho wed that these isolat es all belo ng ed to the genoty pe 1o f rabies virus,in which obvious g enetic div erg ence existed betw een 6represent a -tiv e Chinese st rains of v ir us and t he v accine str ains at the nucleot ide and amino acid lev els.H ow ever ,the vaccine strain CT N fo r human use show ed the hig her homolog y w ith mo st of the Chinese stra ins w hich had a clo se ev olut ionary r elatio nship w ith stra ins iso lated fro m so ut h and so uthw est Asia and they wer e all belong ed to the same g enet ic branch of in the phylo genesis.T he r esults in sequence compariso n indicat ed that the Chinese str ains of virus shared at least 82.3%homo lo gy at the nucleotide lev el and at least 92.1%amino acid identity at the amino acid lev el respectiv ely.Co mpar ison o f the str ains of virus w ith t he vaccine strains r ev ealed the ho molo gy of 79.3%to 94.2%at nucleotide lev el and 87.8%to 97.9%at am ino acid lev el r espec -tiv ely.F rom these observations,it is co ncluded that the ho molog y of most of the Chinese st rains of virus and the CT L v accine stra in is obvio usly hig her that those of ot her vaccine str ains of viruses.KEY WORDS:r abies v ir us;molecular epidemio lo gy ;G gene;sequence;China*国家863基金资助项目(2007AA022402)通讯作者:徐葛林,Em ail:x ugelin @yah 作者单位:1.武汉生物制品研究所狂犬病检测中心,武汉430060;2.贵州省疾病预防控制中心,贵阳 550004狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus,RABV)引起的人畜共患病。

狂犬病灭活疫苗PV2061株的免疫原性试验

狂犬病灭活疫苗PV2061株的免疫原性试验

狂犬病灭活疫苗PV2061株的免疫原性试验张晓华;杨琪;王庆波;张立波【摘要】本试验对兽用狂犬病灭活疫苗PV2061株的保护效率进行评估,分别以常量、1/2剂量和1/4剂量免疫本动物并进行街毒攻击试验.血清中和抗体检测结果表明,前2组在免疫4周后抗体阳性率均为100％,抗体的平均滴度分别为4.86IU/mL和1.18 IU/mL,1/4剂量组的抗体滴度较低,平均滴度仅为0.36 IU/mL.攻毒后前2组的保护率为100％,1/4剂量组的保护率为40％,阴性对照组攻毒后全部死亡.对试验犬的脑组织进行直接荧光抗体染色检测表明仅有死亡犬脑组织中有狂犬病病原存在.综上所述,狂犬病灭活疫苗PV2061株正常免疫剂量和1/2免疫剂量的强毒攻击保护率均在80％以上,阴性对照犬的死亡率高于80％,符合国际标准.本试验为灭活疫苗PV2061株的保护效率提供了试验依据,为其实际应用并投入生产奠定了试验基础.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2014(050)002【总页数】2页(P30-31)【关键词】狂犬病;灭活疫苗;攻毒试验;中和抗体【作者】张晓华;杨琪;王庆波;张立波【作者单位】辽宁成大动物药业有限公司,辽宁本溪117000;辽宁成大动物药业有限公司,辽宁本溪117000;中国动物疫病预防控制中心,北京朝阳100125;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5狂犬病是由狂犬病病毒(RV)引起的一种自然疫源性人畜共患传染病。

RV属于弹状病毒科（rhabdoviridae）狂犬病病毒属（lyssavirus）[1]。

狂犬病主要引起神经系统症状，死亡率几乎为100%。

我国是狂犬病的高发区，在过去的60年间，已有12万人死于狂犬病。

RV可以感染所有的温血动物，其中病犬是狂犬病病毒主要传染源。

疫苗接种是预防狂犬病最主要的方法[2]。

WHO建议当动物群体的狂犬病有效免疫率超过70%时，即可控制动物狂犬病的发生和流行[3-4]。