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狂犬病抗体检测标准狂犬病是一种由病毒引起的疾病，它主要通过动物的咬伤或唾液传播给人类。
由于狂犬病在人类中的致死率相当高，因此对疑似暴露于病毒的个体进行抗体检测是非常重要的。
这种检测有助于早期发现感染病例，采取适当的预防措施来避免病毒传播和控制疾病的传播。
狂犬病抗体检测标准包括两个关键方面：样本采集和实验室检测方法。
首先是样本采集。
狂犬病抗体检测通常通过采集个体的血清样本进行。
血清样本是血液中无细胞成分，含有抗体和其他血浆成分的部分。
采集样本时，应使用无菌的注射器或针头抽取2-5毫升的血液，并在一个无菌集装袋中保存和运输。
为了确保准确性和重复性，需要注意以下事项：1.采集血样的时间：在可能被感染的动物咬伤或暴露后，应尽快采集血液样本。
这是因为病毒会在人体内逐渐繁殖并引起感染，而早期采集血样可以确保检测到病毒的早期感染情况。
2.保存和运输：血清样本应该尽快送到实验室进行检测。
如果无法立即送达实验室，样本应在2-8摄氏度下冷藏保存，并在24小时内送达实验室。
长时间的运输和储存可能导致样本中的抗体结构发生变化，从而影响检测结果的准确性。
接下来是实验室检测方法。
狂犬病抗体检测通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测血清中的狂犬病抗体。
这种检测方法具有高度的敏感性和特异性，可以快速而有效地检测出抗体的存在。
ELISA检测方法基于抗体和抗原之间的特异性结合原理：当抗原与其对应的抗体结合时，会发生可见的颜色反应。
在进行狂犬病抗体检测时，实验室会使用已知病毒抗原来与患者的血清样本进行反应。
如果患者的血清中存在狂犬病抗体，就会发生可见的颜色反应，以证明阳性结果。
为了确保狂犬病抗体检测的准确性和一致性，有一些标准和指南被制定出来。
这些标准包括：1.狂犬病国际标准血清：这是一种由已知抗体浓度的血清制成的标准样品。
在检测过程中，狂犬病国际标准血清被用作参考样本，以确保检测结果的准确性和可比性。
2.检测结果的解读标准：根据不同的检测方法和实验室标准，可能会存在不同的结果解释标准。
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
附件2 狂犬病实验室检测技术指南1、实验室条件及生物安全操作要求（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。
（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。
（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。
没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。
（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。
（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。
（6）实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。
2、实验室检测网络组成及职责（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。
（2）中国疾病预防控制中心职责A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；C.对各级实验室检测人员进行技术培训。
D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。
（3）省级疾病预防控制中心职责A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。
B.辖区内各种标本的实验室检测。
C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。
（4）县级监测点疾病预防控制中心职责采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。
3、实验室检测方法（1）病原检测：A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。
B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µl/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。
狂犬病的实验室检测与诊断技术武汉生物制品研究所基因工程室严家新研究员一、狂犬病实验室检测与诊断技术的用途1. 狂犬病人存活期内的实验室诊断：目前尚无实验室方法可确认处于潜伏期的狂犬病人。
对可能感染狂犬病毒而尚未发病（即处于潜伏期）的人应尽快接种狂犬病疫苗，必要时还要同时接种抗血清。
国外文献上比较可靠的研究结果已证明，狂犬病的潜伏期可能超过6年。
狂犬病疫苗在暴露后接种越快越好，但只要是在发病前，接种疫苗都会有保护作用，补种疫苗可以说没有时间限制。
狂犬病人一旦发病，其死亡率为100%。
病人在发病后最初几天，检测狂犬病毒的抗原一般是敏感的，常可在其唾液、角膜印片、尿液或皮肤中检出病毒抗原。
检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查。
但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。
皮肤活组织检查最好从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。
出现早期症状时检测抗原，仅有25-50%的患者为阳性；随着病情的进展阳性率也增加。
而脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后7—10天才出现。
但在国内护理条件下，狂犬病人发病后，很少能维持生命7天以上。
2. 动物和人狂犬病的死后诊断：可用抗原检测、病毒分离、病毒鉴定等方法进行死因确诊和病毒来源、演化分析。
3. 测定狂犬病毒的抗体:主要用于确定人或动物接种狂犬病疫苗是否成功。
W H O狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5 IU/ml的抗体水平表示免疫接种成功，能得到有效的保护。
前段时间国内因狂犬病疫苗假冒伪劣产品猖獗，而狂犬病疫苗的质量又是性命攸关的事，疫苗接种者主动要求在疫苗接种后测抗体的越来越多，这是可以理解的。
但只要疫苗的质量和供货渠道（包括保存条件）可靠，通常并不要求每个接种者都检测抗体。
因为除非接种者本身可能有免疫功能方面的异常，合格疫苗的抗体阳转率应为100%。
二、狂犬病的实验室检测与诊断的必要性典型的狂犬病的临床表现十分典型，但也有约40%的狂犬病例属瘫痪型，其表现并不典型，很容易与其他疾病混淆，所以实验室检测手段对狂犬病的确诊非常必要。
狂犬病病毒中和抗体检测实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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附件2 狂犬病实验室检测技术指南1、实验室条件及生物安全操作要求（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。
（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。
（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。
没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。
（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。
（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。
（6）实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。
2、实验室检测网络组成及职责（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。
（2）中国疾病预防控制中心职责A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；C.对各级实验室检测人员进行技术培训。
D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。
（3）省级疾病预防控制中心职责A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。
B.辖区内各种标本的实验室检测。
C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。
（4）县级监测点疾病预防控制中心职责采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。
3、实验室检测方法（1）病原检测：A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。
B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µ l/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。
实验十四狂犬病的实验室诊断目的掌握狂犬病的病理组织学和动物试验诊断技术。
内容及方法一、病理组织学检查1．病料的采取对疑为狂犬病而扑杀或死亡的小动物可送检完整的新鲜尸体，如为大动物，则送检未剖开的头或保存于30％甘油中的新鲜大脑。
采取病料时，按一般方法剖开头骨，术者须戴胶皮手套及防护眼镜，以免病料侵入皮肤或溅人眼内。
头骨打开后小心地将脑取出，置于一盘中。
作生物学试验时，可采取脑的任何部分，而检查内基氏小体时，则常采取脑海马角、小脑和延脑。
摘除海马角最简单的一种方法是从脑底面采取，即将脑底朝上放，切除小脑，此时可在内面见到海马回(图8左)。
然后将海马回的边缘稍翻转，即可在它下面看到海马角(图8右)。
2．切片及触片的检查(1) 切片的制作从海马角横切下几块3～4mm厚的组织，浸泡在固定液中，按常规制作切片。
(2) 触片的制作取海马角一小块,用锐利的外科刀或刀片取一小块组织,使断面向上贴于软木塞上或木片上,以清洁的载玻片细心地接触切面，按压2～3个捺印，一份病料做3～4张触片。
(3)切片或触片的染色镜检塞勒(Seller)氏染色法：标本不需事先固定，直接将玻片浸入塞勒氏染液中，染色3～5s。
染色液配制法如下：碱性复红饱和甲醇溶液2～4ml (100ml甲醇内加复红6～8g)；美蓝饱和甲醇溶液15～20ml (100ml甲醇内加美蓝1．5g)；甲醇(不含丙酮者)25ml；先将后两液混合，再加入前液。
经3～5s染色后用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。
内基氏小体染成樱桃红色，嗜碱性组织与细胞核呈深蓝色，细胞浆呈蓝紫色，间质呈粉红色，而神经鞘不着色，红细胞染成古铜色，杂菌为深蓝色。
曼(Mann)氏染色法：染液配制 l％复红水溶液35ml，1％美蓝水溶液35ml，加蒸馏水l00ml。
碱性纯酒精(1％苛性钠无水酒精溶液lml，无水酒精30m1)。
微酸性水(蒸馏水l00ml加纯醋酸2～3滴)。
染色法将触片或脱脂的切片浸入前液中5min，染色后迅速在水中洗涤并用滤纸吸干，然后置于无水酒精中洗涤并置于碱性纯酒精中20s。
狂犬病实验室诊断一、狂犬病实验室诊断病人发病后（死亡前）可采集其唾液（间隔3-6小时，至少采集3份）、脑脊液、血清及颈后带毛囊的小块皮肤；病人死后最好采集其脑组织标本（小脑和脑干）进行实验室检测。
直接免疫荧光法是狂犬病诊断的金标准，可以快速、敏感、特异地检测人和动物脑组织中的病毒抗原。
临床病例活体组织标本（如颈后部皮肤毛囊）亦可进行DFA检测。
直接快速免疫组化法及酶联免疫吸附测定法亦可特异检测狂犬病病毒抗原。
病毒核酸检测可用于早期诊断，以逆转录PCR法检测体液（唾液、血清等）和脑组织等标本，但需要严格的质量控制以保证结果的准确性。
脑组织及唾液等病毒含量高的样本还可进行病毒分离。
细胞培养分离所需时间（1-2天）远少于小鼠颅内接种分离法所需时间（10-21天），且前者的生物安全风险远小于后者。
未接种过疫苗的患者，发病早期几乎没有中和抗体产生，到发病晚期（通常在临床症状出现后7-8天），病毒在脑内大量增殖后突破血脑屏障进入血液，刺激机体产生低水平的中和抗体。
通过病毒中和试验检测病人血清或脑脊液中的中和抗体，可作为狂犬病诊断的依据之一。
世界卫生组织（WHO）推荐的抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和小鼠脑内中和试验（MNT）。
由于RFFIT法无需使用小鼠，所用时间短（24小时），目前已被广泛采用。
RFFIT方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。
此外，常用的狂犬病病毒中和抗体检测方法还有荧光抗体病毒中和试验（FAVNT）。
用ELISA法测定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗体滴度与用病毒中和试验测定的结果有一定的相关性（约80%符合率），但相应试剂盒尚未普及。
此外，还可以通过检测中和抗体，监测暴露前抗体背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。
WHO狂犬病专家咨询委员会认为：中和抗体水平等于或高于0．5IU/ml时，接种者才具备了有效的保护能力；如果发现中和抗体水平低于0．5IU/ml，应进行加强免疫，至达到有效保护水平为止。
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病毒引起的急性传染病，对人和动物都具有很高的致死率。
早期诊断狂犬病对于采取相应的防控措施以避免病毒传播至人群至关重要。
本文将介绍狂犬病的实验诊断方法，主要包括病理学，病毒学和免疫学诊断。
1.病理学诊断:病理学诊断是狂犬病的“金标准”，通常通过病毒抗原在中枢神经系统的分布和形态学改变来确定疾病的诊断。
疾病的确诊依赖于对患者或动物的脑组织进行取样，并通过病理学切片染色和显微镜观察来确定病毒的存在。
狂犬病的典型病理学特征包括神经细胞的溶解,脑脊液中细胞核的损害以及神经组织的炎症反应。
病理学诊断的优势是可以直接观察到病毒在病变中的分布和相关的病理学改变。
然而，病理学诊断需要从已经死亡的动物或人体中取样，可能需要相当长的时间才能完成。
2.病毒学诊断:狂犬病的病毒学诊断主要侧重于检测体液和组织样本中的病毒。
常见的病毒学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光分析法（IFA）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
这些方法允许检测狂犬病病毒的核酸或抗原，从而确定疾病的存在。
病毒学诊断的优势是速度快、操作简单，可以在疾病早期进行检测。
然而，由于狂犬病病毒在体内繁殖速度较慢，且体液中的病毒含量较低，因此病毒学诊断的灵敏度可能较低。
3.免疫学诊断:免疫学诊断主要通过检测抗体来确定狂犬病的感染。
常见的免疫学诊断方法包括狂犬病抗体中和试验，免疫荧光抗体试验（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。
这些方法可以检测体液中的病毒抗体或使用重组病毒抗原刺激免疫反应，从而确定患者或动物是否感染了狂犬病病毒。
免疫学诊断的优势是灵敏度较高，适用于早期诊断和在感染后一段时间进行检测。
然而，免疫学诊断的主要限制是需要患者或动物具备足够的免疫反应来产生抗体，这可能需要一定的时间。
总结起来，狂犬病的实验诊断方法主要包括病理学、病毒学和免疫学诊断。
病理学诊断是诊断狂犬病的“金标准”，但需要取样和患者死亡，所以时间较长。
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。
早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。
因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。
目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。
直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。
它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。
通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。
这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。
然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。
滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。
该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。
这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。
这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。
然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。
聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。
它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。
首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。
这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。
此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。
狂犬病毒ELISA抗体检测试验一、试验材料：1．预包被狂犬病毒抗原的微孔板2．酶标记物3．狂犬病毒IgG阳性对照4．狂犬病毒IgG临界对照5．狂犬病毒IgG阴性对照6．显色液A7．显色液B8．终止液9．浓缩洗涤液（10倍）10．样品稀释液11．封板膜二、操作方法：1．试剂盒放置室温平衡20～30分钟。
取出浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作10倍稀释备用。
2．稀释样品：将已分离好的血清用样品稀释液做1:100稀释（即取10μl血清或血浆加入到1ml样品稀释液中），并充分混匀。
3．加样：取所需量的预包被微孔板条固定于板架上，加入稀释好的样品，100μl/孔，然后将阳性、阴性对照各加1孔，临界对照加3孔，100μl/孔，另留一孔不加样品作空白对照孔，在记录纸上记录各样品和对照品的次序或位置。
剩余的板条放入密封袋中保存。
4．孵育：加样完成后，置37℃恒温箱或水浴箱（用封板膜覆盖板条，以避免水珠滴入微孔）中孵育30分钟。
5．洗板：甩净孔中液体，拍干，用稀释好的洗涤液加满每孔，停留1分钟后甩净、拍干，反复洗板3次。
6．加酶：除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物50μl（1滴），置37℃孵育30分钟。
7．显色：按第5步洗板3次，拍干后每孔（含空白孔）垂直滴加显色液A、B各50μl（1滴），置37℃避光显色15分钟。
8．终止：每孔（含空白孔）立即加入终止液50μl（1滴），混匀后用酶标仪450nm波长测定A值。
三、结果判定：1．单波长检测：以空白孔调零，用酶标仪读取450nm处的A值。
2．双波长检测：用酶标仪读取450nm和630nm处的A值，以A450nm—A630nm计算A值。
3．阴性对照A值≤0.15,0.20≤临界对照A值平均值≤0.80，临界对照A值平均值/阴性对照A值平均值≥2.0，阳性对照A值＞临界对照A值平均值，证明实验成立，否则试验结果无效，需重新试验。
4．如样品孔A值≥临界对照A值的平均值判为阳性；反之为阴性。
狂犬病毒ELISA抗体检测试验一、试验材料：1．预包被狂犬病毒抗原的微孔板2．酶标记物3．狂犬病毒IgG阳性对照4．狂犬病毒IgG临界对照5．狂犬病毒IgG阴性对照6．显色液A7．显色液B8．终止液9．浓缩洗涤液（10倍）10．样品稀释液11．封板膜二、操作方法：1．试剂盒放置室温平衡20～30分钟。
取出浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作10倍稀释备用。
2．稀释样品：将已分离好的血清用样品稀释液做1:100稀释（即取10μl血清或血浆加入到1ml样品稀释液中），并充分混匀。
3．加样：取所需量的预包被微孔板条固定于板架上，加入稀释好的样品，100μl/孔，然后将阳性、阴性对照各加1孔，临界对照加3孔，100μl/孔，另留一孔不加样品作空白对照孔，在记录纸上记录各样品和对照品的次序或位置。
剩余的板条放入密封袋中保存。
4．孵育：加样完成后，置37℃恒温箱或水浴箱（用封板膜覆盖板条，以避免水珠滴入微孔）中孵育30分钟。
5．洗板：甩净孔中液体，拍干，用稀释好的洗涤液加满每孔，停留1分钟后甩净、拍干，反复洗板3次。
6．加酶：除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物50μl（1滴），置37℃孵育30分钟。
7．显色：按第5步洗板3次，拍干后每孔（含空白孔）垂直滴加显色液A、B各50μl（1滴），置37℃避光显色15分钟。
8．终止：每孔（含空白孔）立即加入终止液50μl（1滴），混匀后用酶标仪450nm波长测定A值。
三、结果判定：1．单波长检测：以空白孔调零，用酶标仪读取450nm处的A值。
2．双波长检测：用酶标仪读取450nm和630nm处的A值，以A450nm—A630nm计算A值。
3．阴性对照A值≤0.15,0.20≤临界对照A值平均值≤0.80，临界对照A值平均值/阴性对照A值平均值≥2.0，阳性对照A值＞临界对照A值平均值，证明实验成立，否则试验结果无效，需重新试验。
4．如样品孔A值≥临界对照A值的平均值判为阳性；反之为阴性。
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白(Matrix，简称M)，是狂犬病毒的最小结构蛋白。
病毒的中央核心是一个直径为40nm的核衣壳，核衣壳(Nucleocaps)由病毒核酸(-ssRNA)和紧密包在其外面的蛋白组成，呈紧密的连续性螺旋形式，它充满在由脂蛋白外壳形成的空间内，有30一35个卷曲。
每个病毒约有1800个紧密排列的核蛋白。
另外两种核衣壳核心的蛋白为大转录酶蛋白或称RNA多聚酶(Polymerase，简称L)和磷蛋白(Phosphoprotein，简称P)。
N、P和L三种蛋白总称为核糖核酸蛋白(Ribonueleoprotein，简称RNP)[6]。
2、狂犬病病毒基因组结构RV基因组为不分节段的单股负链RNA，分子质量约为4.6×106，大小约为12kb，由7个功能区组成，包括3′先导区、5个连续的结构基因和5′非转录区。
其中约91％的核苷酸为结构基因，由3′端poly（A）→5’ 端AACA依次为N、P、M、G、L，其长度分别为1421、991、804或805，1675或2059、2069，和6429 或6384个核苷酸，对应的开放读码框（(Open reading frame ,ORF）大小依次为1353、894、609、1575、6429个核苷酸，分别编码核蛋白（NP）、磷蛋白（PP）、基质蛋白（MP）、糖蛋白（GP）和依赖RNA的RNA多聚酶（LP）。
在狂犬病病毒3ˊ端有一段58个核苷酸的先导序列，第59位核苷酸是N基因mRNA5ˊ端的起始位点,第一个开放阅读框架是第71位的ATG起始密码子和第1424位的TAA终止密码子之间延伸,编码病毒的核蛋白,核蛋白基因高度保守又高效表达,可以用于狂犬病毒感染的诊断和调查。
各结构基因之间的间隔区核苷酸分别为2、5、5、423nt[7]。
其中G－L之间的居间序列为伪基因，在某些类型的病毒中可以转录出第6个mRNA。
3、狂犬病病毒的实验室检测3.1病毒形态学观察电镜观察:病毒颗粒呈圆柱体，底部扁平，另一端钝圆,整个病毒粒子的外型呈子弹状，直径75nm，长130~200nm。
表面有1072~1900个突起，排列整齐，于负染标本中表现为六边形蜂房状结构。
3.2 组织病理学检测狂犬病引起的脑炎主要体现在病毒对神经的广泛侵入, 但只局限于细胞损伤[10狂犬病毒G,N基因的表达]。
组织病理学变化为一定程度的脑水肿,不存在其他特异的组织病理学变化。
据Jogai S.等[8]报道,Adlochi Negri于1903在狂犬病感染组织内观察到胞浆内嗜酸性包涵体,这些包涵体被命名为Negri小体,因此可通过检测Negri小体来确诊狂犬病。
Negri小体大多出现在海马回、大脑皮质锥体细胞和浦肯也氏细胞中,较少出现在丘脑、桥脑、髓质、脊髓和感觉神经节等神经组织中。
组织切片及海马回、脑干、小脑新鲜组织涂片经Sllers，苏木精-伊红，Mann或其他物质染色后，可观察到Negri小体的存在。
Negri小体是典型的圆形或椭圆形有嗜碱性颗粒的嗜酸性物质[9]。
该方法优缺点：当组织学检查发现有狂犬病特征性病变时,通过检测内基氏小体,能达到简便、快速地确诊。
然而从感染病毒的动物标本中检测Negri小体，只有50% ~80%的检出率。
因此,镜检Negri小体,虽然快速而且容易操作,但检测方法的敏感度不够。
3.3 生物学检测3.3.1乳鼠颅内接种分离狂犬病病毒法此方法最初用于狂犬病的诊断是在1935年[10]。
改良后MIT,即小鼠病毒中和试验(MVNT)被广泛用于疫苗接种动物和人的抗体检测[11][12]。
依照WHO狂犬病专家委员会推荐[13],荧光抗体实验检测阴性的结果的脑样品必须再次经MIT证实。
狂犬病病毒具有较强的嗜神经性,可采用小鼠颅内接种法分离病毒后,再进行狂犬病特异性抗原的检测。
MIT具体操作方法为:采集脑或唾液腺等病料加缓冲盐水研磨成10%乳剂,无菌处理后离心,取上清液脑内接种5~7日龄乳鼠,性别、品种不限，每只0. 03 mL,每份标本接种4~6只。
乳鼠在接种后继续由母鼠同窝哺养, 3~4 d后如发现哺乳减少,痉挛,麻痹死亡,即可取脑检查包涵体。
如经7 d仍不发病,可杀死其中2只,剖取鼠脑作成悬液,如上传代。
如第二代仍不发病,可再传代。
连续盲传三代总计观察4周而仍不发病者,作阴性结果报告。
也可应用3周龄以内的幼鼠,如上作脑内接种。
可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离,从流行病学角度考虑,检查唾液腺中的病毒更为重要,但脑组织的病毒检出率更高。
在欧、美等发达国家,小鼠接种试验逐渐被细胞培养所取代,但小鼠接种试验仍然是发展中国家用以确诊狂犬病的重要检测方法。
MIT方法优缺点：小鼠接种试验敏感，准确率高，适于不具备组织培养条件的实验室检测、分离狂犬病病毒,但耗时较长,仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病病毒感染,常常需要配合免疫荧光法（见下文）作特异性鉴定。
3.3.2细胞培养分离技术20世纪70年代中期以来,各实验室相继用地鼠肾传代细胞(BHK-21)、鸡胚细胞、鼠成神经细胞瘤细胞(NAC1300)、鼠神经瘤细胞(MNa)和其他传代或原代细胞系分离狂犬病病毒街毒。
CIT技术逐渐取代了MIT，是因为CIT技术费用较低，敏感、易于操作，与MIT相比所需时间大大缩短，即从MIT的30天缩短到RTCIT的4天[14]。
有研究表明,MNa和NAC1300细胞分离街毒的敏感性并不低于MIT法[15][16]，如果接种物中含有少量的街毒,颅内接种小鼠,仅有50%的分离率,而用CIT检出达99%,但BHK-21细胞分离街毒的敏感性较MNa和NAC1300细胞低。
一般来讲,在细胞培养中,感染狂犬病毒的细胞不出现明显的细胞病变(cytoPathiceffect,cPE),但可在接种3~5天时,通过免疫荧光染色（见下文）来检测狂犬病毒是否存在.当病料样品如唾液、脑脊液中所含病毒量很少时,则需要延长培养时间或进行传代培养[17]。
该方法的优缺点:周期短、敏感、成本低,适合大量样本的检测;但本方法需配合免疫荧光进行特异性诊断,需在具备组织培养条件的实验室中进行;样品严重污染细菌或腐败致使样品中病毒失活,会导致病毒分离失败。
3 .4狂犬病病毒抗原抗体检测3.4.1 荧光抗体试验荧光抗体实验(Fluorescent Antibody Test, FAT) 狂犬病病毒感染的细胞内有由狂犬病病毒核衣壳聚集形成的包含体。
据Dean DJ.等[18]报道, 荧光抗体试验于1958年开始应用,且在20世纪70年代用作狂犬病诊断的常规方法。
目前利用荧光抗体实验对抗原进行检测的方法已经渐渐取代了对包含体的检测，该方法是狂犬病参考实验室诊断最常用、最精确、快速和最可靠的方法[19]。
FAT操作方法为:脑或神经组织印片、涂片或冰冻切片,与经过异硫氰酸荧光素标记的狂犬病病毒抗血清或免疫球蛋白相互作用,然后在荧光显微镜下进行检查,狂犬病病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒,呈不同的形状和大小,较大的圆形或椭圆形发出强烈荧光者为Negri小体,沙粒或细小的灰尘荧光粒子及丝状荧光物,则为神经元或树突中含有的狂犬病病毒颗粒,荧光颗粒大小范围为0. 24~27Lm。
以多克隆抗体为基础建立的FAT,其敏感性及特异性不及MIT,但是,如果利用单克隆抗体,可以增加本方法的特异性,并能区别狂犬病病毒和其他的狂犬病病毒属成员[20][21]。
荧光抗体试验的优缺点：耗时短,整个荧光抗体试验操作仅需30min,若加上涂片、固定,得出结果仅需1~2 h; 敏感性和特异性好;但是需要荧光显微镜、高质量的荧光标记抗体，以及具有良好素养的技术员。
3.4.2免疫组织化学上个世纪80年代以来,应用各种类型的免疫组织化学方法,在用福尔马林固定病理标本的切片上进行狂犬病毒病毒抗原检测,用以研究狂犬病毒病毒致病机理以及人和动物狂犬病的诊断研究上[22][23][24][25][26][27]。
它是以狂犬病特异性单克隆抗体和多克隆抗体作为一抗(Primary antibodies),以过氧化酶或亲和素-生物素蛋白标记的种属特异性抗体为二抗(secondary antibodies)。
研究结果表明, 该方法的敏感度与FAT相同或更高,高于Negri小体组织学检测方法。
其它报道也证明过氧化酶标记的方法能获得更好的检测结果[28]曾经有报道,使用亲和素-生物素复合物(Avidin-biotin complex,ABC))和过氧物酶-抗氧化物酶(Peroxidase-antiperoxidase,PAP)结合操作,这两种方法可迅速增强酶促反应，进一步提高其敏感度。
直接免疫过氧化物酶技术或者ABC和PAP系统的优缺点：可以用福尔马林固定的标本作为检测的材料,并且还有相对简单,对材料的处理容易、风险较小等优点[29]。
