狂犬病街毒的分离与鉴定

狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。

一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。

现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。

关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。

RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。

脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。

据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。

尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。

中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。

检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。

下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。

1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。

电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。

病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。

狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。

一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。

现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。

关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。

RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。

脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。

据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。

尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。

中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。

检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。

下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。

1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。

电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。

病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。

附件2 狂犬病实验室检测技术指南1、实验室条件及生物安全操作要求（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。

（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。

（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。

没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。

（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。

（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。

（6）实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。

2、实验室检测网络组成及职责（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。

（2）中国疾病预防控制中心职责A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；C.对各级实验室检测人员进行技术培训。

D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。

（3）省级疾病预防控制中心职责A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。

B.辖区内各种标本的实验室检测。

C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。

（4）县级监测点疾病预防控制中心职责采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。

3、实验室检测方法（1）病原检测：A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。

B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µl/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。

附件2 狂犬病实验室检测技术指南1、实验室条件及生物安全操作要求（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。

（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。

（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。

没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。

（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。

（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。

（6）实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。

2、实验室检测网络组成及职责（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。

（2）中国疾病预防控制中心职责A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；C.对各级实验室检测人员进行技术培训。

D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。

（3）省级疾病预防控制中心职责A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。

B.辖区内各种标本的实验室检测。

C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。

（4）县级监测点疾病预防控制中心职责采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。

3、实验室检测方法（1）病原检测：A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。

B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µ l/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。