格林-巴利综合征急性期外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞的检测

２９４　［文章编号］１０００—２２００（２００９）０４－０２９４—０４　Ｊ　Ｂｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄ　Ｃｏｌｌ，Ａｐｒｉｌ　２００９，Ｖｏ１．３４，Ｎ０

．４　

格林一巴利综合征急性期外周血　Ｔ淋巴细胞亚群及ＮＫ细胞的检测　李奕贵　，陈齐鸣　，李柏青　

・基础医学・　

［摘要］目的：检测格林～巴利综合征（Ｇｕｉｌｌａｉｎ—Ｂａｒｒ６　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＧＢＳ）患者急性期外周血中Ｔ淋巴细胞及其亚群和ＮＫ细胞的变　化，并探讨ＧＢＳ发病机制。方法：采集１２名健康者及１２例ＧＢＳ急性早期患者的静脉血，肝素抗凝，荧光标记，流式细胞术检　测活化性Ｔ细胞、ＣＤ４　Ｔ细胞、ＣＤ８　Ｔ细胞、活化性ＣＤ４　Ｔ细胞、调节性Ｔ细胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１和Ｔｈ２数量及相对比例。结果：　与对照组比较，ＧＢＳ患者外周血中总的活化性Ｔ细胞、活化性ＣＤ４　Ｔ细胞及Ｔｈｌ细胞显著增高，Ｔｒｅｇ则明显降低，差异有统计　学意义（Ｐ＜０．０１）。４例１５天后复查（急性后期），Ｔｒｅｇ细胞、Ｔｈｌ细胞进一步降低，与急性早期相比差异有统计学意义（Ｐ＜　０．０１和Ｐ＜０．０５）。结论：ＧＢＳ患者急性早期机体免疫功能处于过度激活状态，免疫性病理损伤可能主要由Ｔｈｌ细胞介导。　Ｔｒｅｇ所介导的免疫抑制功能减低，其与ＧＢＳ发病及神经功能恢复的关系有待进一步探讨。　［关键词］脱髓鞘疾病；格林一巴利综合征；Ｔ细胞亚群；ＮＫ细胞　［中国图书资料分类法分类号］Ｒ　７４４．５　［文献标识码］Ａ　

Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｓｕｂｓｅｔｓ　ａｎｄ　ＮＫ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ａｃｕｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ６　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｕ　１】『ｉ—ｇｕｉ　．ＣＨＥＮ　Ｑｉ－ｍｉｎｇ２．ＬＩ　Ｂａｉ—ｑｉｎｇ３　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｅｆｅｉ　Ａｎｈｕｉ　２３００１１；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＢｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｎｇｂｕ　Ａｎｈｕｉ　２３３００４；　３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｂｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｎｇｂｕ　Ａｎｈｕｉ　２３３０３０，Ｃｈｉｎａ）　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｓｕｂｓｅｔｓ　ａｎｄ　ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｇｕｉｌｌａｉｎ—Ｂａｒｒ￣ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＧＢＳ），ａｎｄ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ＧＢＳ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　１２　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＧＢＳ　ａｔ　ｔｈｅ　ａｃｕｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｆｒｏｍ　１２　ｈｅａｌｔｈｙ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｔｏ　ｄｅｆｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＤ４　Ｔ　ｃｅｌｌｓ，ＣＤ８　Ｔ　ｃｅｌｌｓ，ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ，ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ（Ｔｒｅｇ），ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　３＂ｈｌ　ａｎｄ　Ｔｈ２　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ，　ｉｔｓ　ｓｕｂｓｅｔ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＣＤ４　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｔｈｌ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒｅｇ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）．Ｆｏｕｒ　ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　１２　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｇａｉｎ（１５　ｄａｙｓ　ｌａｔｅｒ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒｅｇ　ａｔ　ｔｈｅ　ｌａｔｅ—　ａｃｕｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．Ｏ１）ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ・ａｃｕｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｌ　ｃｅｌｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌａｔｅ—ａｃｕｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ａｃｕｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＧＢＳ　ｍａｙ　ｂｅ　ｏｖｅｒ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ａｃｕｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｍｍｕｎｅ　ｉｎｊｕｒｅｓ　ｉｎ　ＧＢＳ　ｍａｙ　ｂｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｔｈｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅｇ—ｃｅｌｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ＧＢＳ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｎｅｒｖｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ　ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｇｕｉｌｌａｉｎ—Ｂａｒｒ６　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｓｕｂｓｅｔｓ；ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌｓ　

格林一巴利综合征（Ｇｕｉｌｌａｉｎ—Ｂａｒｒ６　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，　ＧＢＳ）又称急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，是急　性及亚急性起病的周围神经瘫痪性疾病，以基本对　称性肢体瘫痪和腱反射消失为临床特征。其确切发　病机制不清，目前认为细胞免疫在发病中起主要作　用，抗体介导的免疫损伤与急性运动轴索型神经病　［收稿日期］２００８－０３－０４　［作者单位］１．安徽省立友谊医院神经内科，安徽合肥２３００１１；　２．蚌埠医学院第一附属医院神经内科，安徽蚌埠　２３３００４；３．蚌埠医学院免疫学教研室，安徽蚌埠　２３３０３０　［作者简介］李奕贵（１９７１一），男，硕士，住院医师．　及Ｆｉｓｈｅｒ综合征发病有关　。关于ＧＢＳ患者外周　血Ｔ细胞亚群变化报道结果不一，有报道　ＧＢＳ　患者急性期血清　．干扰素增高，恢复期逐渐降至正　常；白细胞介素＿４含量恢复期较急性期升高，提示　可能存在辅助性Ｔ细胞（Ｔ　ｈｅｌｐｅｒ，Ｔｈ）平衡紊乱。　本实验对ＧＢＳ患者急性期外周血Ｔ细胞亚群进行　检测，从而探讨ＧＢＳ的发病机制。　

１资料与方法　１．１　一般资料本组ｌ２例ＧＢＳ患者均符合美国　Ａｓｂｕｒｙ　１９９０年修订的ＧＢＳ临床诊断标准，男８例，　女４例；年龄（４１．５８±８．９）岁。初次检测于ＧＢＳ神　经系统症状出现后１～１０天（急性早期）进行，其中　蚌埠医学院学报２００９年４月第３４卷第４期　可随访的４例，１５天（发病第１５～２５天，为急性后　期）后复查。对照组１２名，男９名，女３名；年龄　（３８．８±９．２）岁，为蚌埠医学院免疫实验中心和蚌　埠医学院第一附属医院神经内科健康工作人员。　１．２　主要试剂及仪器　ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＦＩＴＣ和ａｎｔｉ—ＣＤ８一　ＰＥ（天津协科生物技术公司），ａｎｔｉ—ＣＤ４．ＰＥ—Ｃｙ５、　ａｎｔｉ—ＩＬ＿４一ＳＡ－ＰＥ—Ｃｙ５和ａｎｔｉ—ＣＤ３－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　公司），ａｎｔｉ—ＩＬ－４．Ｂｉｏｔ和ａｎｔｉ—ＩＦＮ一　一ＦＩＴＣ（Ａｎｃｅｌｌ公　司），ＲＰＭＩ　１６４０（Ｇｉｂｃｏ公司），ＰＦＡ、Ｓａｐｏｎｉｎ、　Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、ＰＭＡ、Ｍｏｎｅｓｉｎ和（Ｓｉｇｍａ公司），ａｎｔｉ—　ＣＤ６９．ＦＩＴＣ、ａｎｔｉ．ＣＤ２５．ＰＥ和流式细胞仪（ＢＤ　公司）。　１．３　方法采用全血法对淋巴细胞进行表面染色，　流式细胞术检测Ｔ淋巴细胞亚群及ＮＫ细胞数量及　比例。为了更好地模拟机体内环境，采用全血法激　活淋巴细胞，对淋巴细胞进行表面染色及细胞内染　色，流式细胞术检测Ｔｈ细胞数量及比例。　１．３．１　Ｔ淋巴细胞亚群及ＮＫ细胞染色（１）采静　脉血３　ｍｌ，肝素抗凝，各取３０　ｌ于每管中，分别加　入ＦＩＴＣ一抗ＣＤ３、ＰＥ一抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤＩ６＋５６、ＨＬＡ—ＤＲ，　ＰＥ．Ｃｙ５－抗ＣＤ２５及对照抗体，室温避光放置２０　ｍｉｎ；（２）溶血剂２　ｍｌ，避光，室温放置１０　ｒａｉｎ，１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清；（３）染色缓冲液１　ｍｌ，　１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清，重复１次；（４）２％　ＰＦＡ　２００　Ｉｚｌ，混匀，保存于４℃待测。　１．３．２　Ｔｈ细胞染色（１）新鲜肝素抗凝血７００　ｌ，　加等量ＲＰＭＩ　１６４０培养液，从中分别取４００　ｔｘｌ放入　对照管。加入ＰＭＡ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ，终浓度分别为　８．１　ｎｍｏ］／Ｌ、２　ｔｘｍｏｌ／Ｌ，３７℃５％ＣＯ２培养２　ｈ；（２）　加人Ｍｏｎｅｎｓｉｎ，终浓度为２　ｐ＋ｍｏｌ／Ｌ，３７　ｏＣ，４　ｈ；（３）　２７　４８ｌ１２　４７　３４　９２ｌ２５　ｌ３　蘑　．　。；馨　’，　黾’　ｏ　１０ｏ　１０　ｌ０　１０　１０　——ＣＤ４———　１０￣１０　１０２　１０３　１０　——ＣＤ３—————＋　ｊ　ｉ】５　０　９０　５３　．‰　。　２９５　弃上清４００　Ｉｘｌ，分取１００　ｌ至流式管，加入ａｎｔｉ—　ＣＤ３　ＡＰＣ、ａｎｔｉ—ＣＤ８．ＰＥ和对照抗体，染色，室温，避　光，２５　ｒａｉｎ；（４）溶血１次，洗涤２次（染色缓冲液，　４℃，１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ）；（５）２％ＰＦＡ固定，染　色缓冲液洗涤２次；（６）０．１％Ｓａｐｏｎｉｎ　２００　Ｉｚｌ透膜　（４℃，１５　ｒａｉｎ），４　ｏＣ　１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心７　ｒａｉｎ，弃上　清；（７）ａｎｔｉ－ＩＦＮ一　．ＦＩＴＣ、ａｎｔｉ—ＩＬ　４ｌ－Ｂｉｏｔ胞内染色，　４　ｃ（＝，避光，３０　ｒａｉｎ；透膜液洗涤１次；（８）ａｎｔｉ—ＳＡ—　ＰＥ—Ｃｙ５再次胞内染色，４℃，避光，３０　ｍｉｎ；透膜液洗　涤１次；（９）１％ＰＦＡ　２００　ｌ，４℃保存，待测。　１．４统计学方法采用ｔ检验。