稳定表达人Fhit突变体细胞系的建立

稳定表达中国人常见GJB2基因突变细胞系的建立张延平;张晓强;刘雅莉;黄玮;孙玉蕊【期刊名称】《中国听力语言康复科学杂志》【年(卷),期】2011(000)004【摘要】目的将中国人常见GJB2基因突变c.235deIC真核表达载体稳定转染入HEK293细胞,建立稳定表达人c.235deIC的HEK293细胞系.方法将pCx26-EGFP和pCx26-235deIC-EGFP转染HEK293细胞,24 h后加G418筛选两周,使用FCM分选GFP阳性细胞,继续培养.蛋白免疫印迹检测GFP表达,激光共聚焦显微镜检测蛋白表达.结果蛋白免疫印迹显示稳定转染人pCx26-EGFP和pCx26-235deIC-EGFP的HEK293细胞都能够检测到GFP的蛋白条带,显微镜下可见稳定表达基因的HEK293细胞普遍表达GFP.结论本研究成功构建了稳定表达中国人常见GJB2基因突变的HEK293细胞系,为今后的研究工作打下基础.【总页数】4页(P11-14)【作者】张延平;张晓强;刘雅莉;黄玮;孙玉蕊【作者单位】中国人民解放军第309医院耳鼻喉科北京100091;中国人民解放军第309医院耳鼻喉科北京100091;河南省医学情报研究所郑州 450052;河南省卫生厅郑州 450052;中国人民解放军第309医院耳鼻喉科北京100091【正文语种】中文【相关文献】1.中国人常见GJB2基因突变片段TA克隆载体构建 [J], 张元丁;张延平;李丽娜;马磊;孙玉蕊;张宗霖;刘金伟;邓惠严;祝威2.盘状结构域受体1过表达慢病毒载体的构建及稳定过表达人胃腺癌BGC823细胞系的建立 [J], 谢瑞霞;李佩容;张翠霞;郭丽芳;尚琪;温萌;张德奎3.HIV-1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立 [J], 李苗苗;杨霄旭;杨朝霞;向双林;韩梅4.可诱导表达hFGFR1α稳定细胞系的建立与表达优化 [J], 朱先玉;王历;杨茂;吴婷;何涛;杨文理;5.RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立 [J], 陈少凤;李胜男;邓福;朱佩仪;李友因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

稳定表达的人自身免疫调节因子HeLa细胞的建立及鉴定于春雷;杨辉;劳凤学;柳忠辉;李一【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2003(029)002【摘要】目的:建立稳定表达人自身免疫调节因子(autoimmune regulator, AIRE)的细胞株.方法:用FuGENE6转染试剂将含AIRE cDNA的真核表达载体转染HeLa 细胞,经G418筛选阳性克隆.继续培养4周,用荧光显微镜观察、流式细胞仪(FACS)检测和免疫印迹法检测AIRE基因在HeLa细胞中的稳定表达情况.结果:经荧光显微镜、流式细胞仪及免疫印迹法检测,证实AIRE基因得到了稳定表达.结论:在FuGENE6转染试剂的介导下,AIRE基因在HeLa细胞内获得稳定表达.【总页数】3页(P155-157)【作者】于春雷;杨辉;劳凤学;柳忠辉;李一【作者单位】吉林大学基础医学院免疫学教研室,吉林,长春,130021;解放军空军第二航空学院医院;吉林大学基础医学院免疫学教研室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院免疫学教研室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院免疫学教研室,吉林,长春,130021【正文语种】中文【中图分类】R593.2;R392.11【相关文献】1.人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定 [J], 杨娅楠;王媛;左志宇;王鑫廷;杨洁2.TET1过表达载体构建及其稳定过表达的宫颈癌HeLa细胞鉴定 [J], 沈艳;沈凤;闫海洋;徐殿琴;丁妍;谭玉洁3.病毒负性调节因子在内皮细胞稳定表达细胞株的建立 [J], 杨凡;刘朝奇;覃晓琳;李斌;韩钰4.稳定表达hNIS基因的人宫颈癌HeLa细胞系的建立及鉴定 [J], 凌莉;汤亚莉;张弘;石怡珍;刘增礼5.新基因PCIA1真核表达载体的构建及HeLa细胞稳定转染株的建立与鉴定* [J], 王瑞;邓洪新;王国庆;严飞;彭枫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

FHIT基因真核细胞表达载体的构建与鉴定
田中伟;宋向凤;彭振辉
【期刊名称】《第三军医大学学报》
【年(卷),期】2004(26)2
【摘要】目的构建人FHIT基因真核细胞表达载体。

方法采用RT PCR方法 ,从人新鲜甲状腺组织的总cDNA中扩增出 45 6bp的人FHITcDNA片段 ,然后用KpnⅠ和BstXⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中 ,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒 ;用免疫细胞化学法检测FHIT基因的表达情况。

结果人FHIT基因cD NA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中 ;体外转染MM96L细胞后 ,可见转染细胞胞浆中有较高量的Fhit蛋白表达。

【总页数】3页(P125-127)
【关键词】FHIT基因;RT-PCR;基因克隆
【作者】田中伟;宋向凤;彭振辉
【作者单位】西安交通大学第二医院皮肤科;河南省新乡医学院免疫学教研室【正文语种】中文
【中图分类】Q782;Q785
【相关文献】
1.HLA-C基因真核细胞表达载体的构建、鉴定及表达 [J], 李卫党;范丽安
2.携带绿色荧光蛋白基因的APP695真核细胞表达载体的构建及鉴定 [J], 梁静;李
宁;王凤斌;张丽娟;鞠吉雨
3.人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析 [J], 陈晓鹏;胡良鹤;王永
4.WWOX基因真核细胞表达载体的构建与鉴定 [J], 闫洪超;陆晓媛;韩秋峪;林新生
5.人β-神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定 [J], 李甫强;王廷华;董坚;梅妍;周鸿鹰;项涛;羊惠君
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稳定表达人Fhit突变体细胞系的建立于芳;绳纪坡;胡宝成【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2012(023)002【摘要】Objective: To construct the eukaiyotic expression vectors of human fragile histidine triad (Fhit) mutation genes and to establish stable expressed cell lines of human Fhit mutants in order to confirm Fhit and replication protein A(RPA) interaction in mammalian cells. Methods: Three Fhil mutant cDNA were inserted into the eukaiyotic expression vector pREPIO containing HA-tag, HeLa cells were transfected with pREP10/HA vector alone or the plasmids pREP10/FhitA/D/F-HA, stable cell lines were selected from hygromycin B resistant colonies and the expressed Fhit mutants were verified by Western blot with HA antibody. Results: The eukaryotic expression vector pREP10/FhitA/D/F-HA was verified by PCR and sequencing, human Fhit mutants were highly expressed in the transfected HeLa cells. Conclusion: Three stable cell lines HeLa-FhitA/D/F expressing Fhit mutant were established, it is the basis to study the role of the interaction between Fhit and RPA in DNA damage response.%目的:构建人脆性组氨酸三联体(Fhit)突变体真核表达载体并建立稳定表达人Fhit突变体的细胞株,以便进一步研究Fhit与复制蛋白A(RPA)在体内的相互作用.方法:将3种人Fhit突变体cDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建人Fhit突变体真核表达载体,转染HeLa细胞,经湖霉素B加压筛选阳性克隆,用Western印迹鉴定稳定表达Fhit突变体蛋白FhitA、FhitD和FhitF的阳性细胞株.结果:经PCR鉴定及序列分析,Fhit突变体基因真核表达载体pREP10/FhitA/D/F-HA构建正确,转染人HeLa细胞,筛选出Fhit突变体表达较高的细胞株.结论:建立了3株稳定表达Fhit突变体的细胞株HeLa-FhitA/D/F,为研究Fhit与RPA的相互作用在DNA损伤应答中发挥的作用奠定了基础.【总页数】3页(P183-185)【作者】于芳;绳纪坡;胡宝成【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q75【相关文献】1.稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白突变体细胞系的建立 [J], 孙静;魏永伟;章晓栋;于涟2.HERG基因G572R突变体表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立 [J], 杨阳;黄娜;高岭;常素娥;郭波;胡丽丽;宋土生;黄辰3.截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立 [J], 鲍艳婷;陈公英;王洁;李鸽;葛柯4.CD151及其突变体在人脐静脉内皮细胞系中的稳定表达 [J], 李鹏程;王赟;左后娟;邹远林;刘正湘5.细胞色素P4502 A13野生型/突变体稳定表达Flp-InTM CHO细胞系的建立 [J], 郑丹丹;李靖;王永林;李勇军;刘亭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第34卷 第5期 2019年10月天津科技大学学报Journal of Tianjin University of Science & TechnologyV ol. 34 No. 5 Oct. 2019收稿日期：2018-05-31；修回日期：2018-06-27 基金项目：国家自然科学基金资助项目(31471335)作者简介：李 薇（1981—），女(蒙古族)，内蒙古自治区人，博士研究生；通信作者：刁爱坡，教授，diaoaipo@稳定表达TFEB-GFP 细胞系的构建及促TFEB 入核药物筛选李 薇1, 2，刘振兴1，杨 萌1，赵 爽1，刁爱坡1(1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特 010110)摘 要：本研究旨在构建稳定表达TFEB-GFP 的HeLa 细胞系，并利用其筛选促进转录因子EB (TFEB )入核药物．利用分子生物学技术成功构建了重组表达载体pLVX-AcGFP1-N1-TFEB ，并进行慢病毒包装，进而侵染HeLa 细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株．采用荧光显微镜技术及免疫印迹技术(Western blot )证实稳定表达TFEB-GFP 细胞株构建成功．利用该细胞模型筛选得到促TFEB 入核药物盐酸舍曲林(Sertraline HCl )，此药物能够促进转录因子TFEB 靶基因的表达，并促进细胞自噬．MTT 实验表明Sertraline HCl 抑制肿瘤细胞活力，其对肿瘤细胞的杀伤作用可能是通过其激活自噬引起的．关键词：转录因子EB ；核转位；盐酸舍曲林；细胞自噬中图分类号：Q291 文献标志码：A 文章编号：1672-6510(2019)05-0021-08Construction of Stably Expressed TFEB -GFP Cell Line and Screening of Drugs Promoting TFEB Nuclear TranslocationLI Wei 1, 2，LIU Zhenxing 1，YANG Meng 1，ZHAO Shuang 1，DIAO Aipo 1(1. College of Biotechnology ，Tianjin University of Science & Technology ，Tianjin 300457，China ；2. College of Basic Medical ，Inner Mongolia Medical University ，Hohhot 010110，China )Abstract ：The purpose of this study is to construct a HeLa cell line which can stably express TFEB-GFP and be used to screen drugs so as to promote TFEB nuclear translocation ．The recombinant expression vector ，pLVX-AcGFP1-N1-TFEB ，was successfully constructed using molecular biology techniques ．Encapsulated-lentiviruses were prepared and used to infect HeLa cells ．Positive monoclonal cell lines expressing TFEB-GFP were generated after puromycin screening and verified with fluorescence microscopy technique and Western blot ．Sertraline HCl ，a drug promoting TFEB into nuclei ，was screened using this cell model ．Sertraline HCl increased the expression of the transcription factor TFEB target genes and promoted cell auto-phagy ．MTT assay showed that Sertraline HCl inhibited cancer cell viability ，and this inhibiting effect might be caused by its activation of autophagy ．Key words ：TFEB ；nuclear translocation ；Sertraline HCl ；autophagy转录因子EB (Transcription Factor EB ，TFEB )是第一个鉴定出的MiTF/TFE 家族的基本螺旋–环–螺旋亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix leucine zipper ，bHLH-Zip )类转录因子[1]．TFEB 的细胞定位和活性调节与其磷酸化修饰状态相关．TFEB 蛋白至少可以在20个位点被磷酸化[2–3]，其中的Ser142和Ser211这两个丝氨酸残基对其亚细胞的定位具有关键作 用[4–7]．当这两个丝氨酸残基都被磷酸化时，TFEB 定位在细胞质中且无转录活性．TFEB 的活性严格地受到翻译后修饰、蛋白质间相互作用和空间组织的调控．在营养丰富的条件下，TFEB 主要以无活性状态存在于细胞质，但在饥饿或溶酶体功能发生障碍的条DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20180170数字出版日期：2019-03-28；数字出版网址：/kcms/detail/12.1355.N.20190328.1522.004.html·22·天津科技大学学报第34卷第5期件下，TFEB迅速转位至细胞核并激活其靶基因的转录[4,8]．研究[9]表明，很多构成溶酶体的蛋白表达由TFEB调控．溶酶体功能正常是维持细胞稳态的必要条件[10]，参与内吞作用、自噬和溶酶体胞吐作用等许多基本的细胞过程[11]．表达溶酶体蛋白增强溶酶体活性，如增强细胞自噬功能，可以防止溶酶体相关疾病的发生．TFEB的失调会导致多种类型的癌症，肿瘤细胞依赖于有效的溶酶体功能，并且在致癌过程期间发生溶酶体组成和数量的多种改变．肾细胞癌(RCC)是由肾小管上皮产生的异质性肿瘤，其中的易位RCC(t-RCC)就是由MiTF/TFE家族成员TFE3和低频率的TFEB有关的基因融合引起的[12–13]．在人类胰腺癌细胞(PANC1)中发现了TFEB的非典型核定位[14]．最近在非整倍体细胞的研究中发现，TFEB 激活是对未降解的自噬物的溶酶体积累后的溶酶体应激的细胞应答[15]．TFEB在对细胞应激反应中起作用，在细胞适应各种内部压力和环境波动中的作用与其全面调节自噬/溶酶体系统的独特能力密切相关．TFEB控制参与调节自噬、线粒体功能、代谢、未折叠蛋白反应(UPR)、凋亡和炎症反应关键基因的表达，具有广泛的功能[16]．此外，TFEB的功能可能具有细胞类型的特异性，它的激活对于肝细胞中的脂质分解代谢、巨噬细胞中的免疫应答以及肌肉中有效的线粒体功能发挥重要作用．但到目前为止，发现的具有诱导TFEB发挥功能的化学药物数量较少，而对于可以利用TFEB作为靶点的治疗肿瘤疾病和神经退行性疾病等顽疾的药物鲜有报道．本研究的目的在于构建稳定表达TFEB-GFP的人子宫颈癌细胞HeLa，采用该细胞模型筛选新的促进TFEB入核并发挥其转录功能的小分子化合物，并研究其对TFEB的诱导作用及对细胞生长的影响．本研究将为以TFEB为靶点调控溶酶体功能的药物发现与应用提供理论和实物基础．1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌种、细胞及质粒大肠杆菌(E.coli)STBL3、人胚肾细胞HEK293T、人子宫颈癌细胞HeLa、人乳腺癌细胞MDA-MB231、稳定表达EGFP-LC3的HeLa细胞，慢病毒表达载体系统包括pLVX-AcGFP1-N1、pMD2.G和psPAX2质粒均为本实验室保存．1.1.2主要试剂Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ、DNA marker、蛋白预染marker、TurboFect™，Thermo公司；PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒，上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技有限公司；胰酶、DMEM高糖培养基、嘌呤霉素、DAPI、LC3抗体，美国Sigma公司；Opti-MEM培养基，美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)，北京索莱宝生物科技有限公司；β-actin抗体、TFEB抗体，Santa公司；p62抗体，CST 公司；Cathepsin B抗体，Abcam公司；Histone抗体、GFP抗体、HRP标记的鼠二抗、兔二抗，天津三箭生物技术有限公司．引物合成和基因测序由北京华大基因公司完成．1.2 方法1.2.1pLVX-AcGFP1-N1-TFEB表达载体的构建应用Primer 5.0软件，根据NCBI数据库中的人TFEB基因序列设计引物．通过比对序列，选择两端加上Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切位点(下划线部分)及保护碱基．引物序列上游为5'-CGGAATTCTGATG GCGTCACGCATAGGGTTGC-3'，下游为5'-CGGG ATCCCGCAGCACATCGCCCTCCTCCATG-3'．以本实验室保存的pcDNA3.1+-flag-TFEB-HA重组质粒为模板，PCR反应体系：上、下游引物(10μmol/L)各2μL、模板cDNA 1μL、10×Pfu Buffer(with MgS O4) 10μL、dNTP Mix(10mmol/ L)2μL、Pfu DNA聚合酶(2.5U/μL)1μL、ddH2O 82μL．反应条件：95℃2min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 3min，共30个循环；72℃5min．扩增得到TFEB基因片段．将纯化后的目的基因片段与pLVX-AcGFP1-N1载体采用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后纯化回收，T4DNA连接酶于16℃连接过夜．连接产物转化STBL3感受态细胞．随机挑取大肠杆菌转化子，接种到5mL含有200μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min摇床振荡培养12～16h．提质粒后采用Taq DNA聚合酶系统进行PCR验证．同时采用Eco RⅠ和Bam HⅠ进行双酶切验证．分别取5μL PCR产物和酶切产物进行琼脂糖凝胶(0.8%)电泳检测．选取经酶切和PCR验证都正确的重组质粒进行测序鉴定.1.2.2细胞培养HEK293T、HeLa、MDA-MB231细胞均用含有10% FBS的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，定期换液传代．2019年10月李 薇，等：稳定表达TFEB-GFP细胞系的构建及促TFEB入核药物筛选·23·1.2.3慢病毒包装在60mm培养皿中接种适量HEK293T细胞，细胞生长24h融合度达70%～80%时进行转染．用Turbofect TM将pLVX-AcGFP1-N1-TFEB重组质粒及pLVX-AcGFP1-N1质粒分别与psPAX2、pMD2.G两个包装质粒按照4﹕3﹕1的比例(共加入6μg)转染HEK293T细胞．转染12h更换新鲜培养基，再分别于24h和48h吸取上清液，将两次收集液合并，分别为实验组病毒收集液及对照组病毒收集液，1500r/min离心15min，小管分装，每管500μL，-80℃避光保存．1.2.4HeLa细胞最佳嘌呤霉素筛选浓度的确定在96孔板中接种适量HeLa细胞，常规培养24h细胞长至70%～80%融合度时，更换含有不同浓度嘌呤霉素的培养基，设置嘌呤霉素终质量浓度为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4µg/mL，每天镜下观察，并隔天更换含有不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基．3～5d后，导致细胞全部死亡的嘌呤霉素最低浓度即为最低致死浓度(一般以4d完全致死为准)．1.2.5构建稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞系在35mm培养皿中接种适量HeLa细胞，常规培养24h细胞长至70%～80%融合度时，更换含有8 μg/mL聚凝胺(polybrene)的新鲜培养基；再分别加入500 μL实验组病毒收集液和对照组病毒收集液，温和地混匀，37℃、5% CO2条件下避光侵染24h；更换含有最佳嘌呤霉素筛选浓度(终质量浓度1μg/mL)的新鲜培养基，筛选培养5d后，计数并重新铺细胞至60mm培养皿，一般每个培养皿700～800个细胞，一直用含有1μg/mL嘌呤霉素的培养基进行培养．待单克隆长至肉眼可见时，将单克隆挑起并转移至新的培养皿扩大培养获得稳定细胞系．荧光显微镜下拍照观察，同时收集细胞，蛋白免疫印迹技术检测成功表达TFEB-GFP的细胞系．1.2.6免疫印迹实验(Western blot)收集对数生长期的细胞，加入适量RIPA细胞裂解液(50mmol/L Tris-Cl(pH 7.4)，150mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA(pH 8.0)，1% TritonX-100，0.1% SDS)(含蛋白酶抑制剂)在冰上裂解30min，4℃离心收集上清液并按比例加入SDS上样缓冲液，经10% SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上，用含有5%脱脂奶粉的PBST缓冲液(膜封闭液)室温封闭1h，于4℃条件下进行一抗(稀释比例分别为TFEB 1﹕200、β-actin 1﹕5000、Histone 1﹕1000、p62 1﹕1000、Cathepsin B 1﹕2000、LC3 1﹕5000、GFP 1﹕1000)孵育过夜，PBST洗膜后再与二抗孵育2h，PVDF膜在MiniChemi TM迷你型化学发光成像仪下曝光成像．1.2.7药物筛选待60mm培养皿中TFEB-GFP稳定细胞系长至所需密度时即可进行96孔板铺板．收集细胞，血球计数板计数，调整细胞悬液的浓度，铺板使待测细胞密度8000个/孔，常规培养24h后加入终浓度为5μmol/L的药物处理，24h时用荧光显微镜拍照观察.1.2.8MTT法检测细胞活力收集对数期HeLa、MDA-MB231细胞接种于96孔板中，血球计数板计数，调整细胞悬液的浓度，铺板使待测细胞密度5000个/孔，设复孔3个．常规培养24h后加入不同浓度的药物处理(1、2.5、5、10、15、20μmol/L)，DMSO为对照组．分别检测24、48、72h的细胞活力．每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4h后，小心吸去孔内培养基，每孔加入200μL DMS O溶解沉淀，置水平摇床上振荡10min，使结晶充分溶解．利用酶标仪检测490nm波长下各孔的吸光度．1.3 统计学处理应用S PS S 18.0软件进行统计分析，采用t检验进行组间比较，*、**和***分别表示P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001．2 结果与分析2.1 pLVX-AcGFP1-N1-TFEB表达载体的构建pLVX-AcGFP1-N1-TFEB表达载体的构建如图1所示．对以pcDNA3.1+-flag-TFEB-HA质粒为模板的PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见大小约为1.5kbp的特异性PCR扩增条带，与预期一致(图1(a))．将纯化后的目的片段与载体pLVX-AcGFP1-N1进行双酶切纯化后连接，转化E.coli STBL3宿主菌，挑取阳性转化子培养，提质粒后进行PCR及双酶切验证，PCR产物和酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测．实验结果显示：PCR扩增出目的条带大小与TFEB基因(1.5kbp)相符(图1(b))；双酶切重组质粒2出现的两条带的大小分别与TFEB基因(1.5kbp)和pLVX-AcGFP1-N1载体(8.8kbp)大小相符(图1(c))．选取电泳条带位置正确的重组质粒2进行测序，验证载体上插入的TFEB cDNA序列方向、位置及大小均正确，表明pLVX-AcGFP1-N1-·24·天津科技大学学报第34卷第5期TFEB重组表达质粒构建成功．(a) TFEB基因的PCR扩增 (b) PCR验证(c) 双酶切验证(a)中M. DNA marke r；1. PCR产物．(b)中M. DNA marke r；1—2. 重组质粒PCR产物；P. 阳性对照；N. 阴性对照．(c)中M. DNA marker；1—2. 重组质粒双酶切产物图1pLVX-AcGFP1-N1-TFEB表达载体的构建Fig. 1Construction of pLVX-AcGFP1-N1-TFEB expres-sion vector2.2 稳定表达TFEB-GFP HeLa细胞系的构建用嘌呤霉素筛选出稳定表达TFEB-GFP的HeLa 细胞株(TFEB-GFP)．对照组病毒收集液侵染的HeLa 细胞作为对照，通过荧光显微镜拍照观察，结果如图2(a)所示，稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞的细胞质中有绿色荧光．对照 TFEB-GFP(a) 荧光显微镜技术检测稳定细胞株TFEB-GFP的表达(b) Western blot检测稳定细胞株TFEB-GFP蛋白的表达图2稳定表达TFEB-GFP HeLa细胞系的鉴定Fig. 2Identification of the expression of TFEB-GFP in the HeLa stable cell lines收集细胞制成蛋白样品，通过Western blot证实实验组TFEB-GFP蛋白表达明显增高(图2(b))．结果表明稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞系构建成功．2.3 Sertraline HCl促进TFEB入核利用稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞模型，对来自Selleck的小分子化合物库中的药物进行筛选．DMSO为阴性对照，Torin 1(终浓度250nmol/L)为阳性对照，荧光显微镜下拍照观察TFEB-GFP的定位，确定Sertraline HCl能够促进TFEB-GFP入核，并且以时间(6、12、24h)依赖性方式诱导TFEB-GFP 核聚集(图3(a))．进一步通过核质分离方法研究S ertraline HCl对内源性TFEB细胞定位的影响．6孔板中接种适宜密度的HeLa、MDA-MB231细胞，24h 后分别换成加了S ertraline HCl(终浓度5μmol/L)的培养基处理24h，DMSO为阴性对照，核质分离以后，以核内TFEB蛋白量比核内参(Histone)蛋白量统计S ertraline HCl处理后TFEB相对核内蛋白量，Western blot检测结果如图3(b，c)所示，Sertraline HCl处理后，HeLa、MDA-MB231细胞核中TFEB蛋白表达量明显比对照组增多，差异有统计学意义，进一步确定Sertraline HCl促进TFEB入核．(a) Sertraline HCl对稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞中TFEB-GFP定位的影响2019年10月 李 薇，等：稳定表达TFEB-GFP 细胞系的构建及促TFEB 入核药物筛选·25·(b ) Sertraline HCl 对HeLa 细胞中TFEB 定位的影响(c ) Sertraline HCl 对MDA-MB231细胞中TFEB 定位的影响图3 Sertraline HCl 促进TFEB 入核Fig. 3 Sertraline HCl promoting TFEB nuclear translo -cation2.4 Sertraline HCl 促进TFEB 靶基因表达 为了研究S ertraline HCl 对HeLa 、MDA-MB231细胞中TFEB 靶基因表达的影响，以DMSO 作为对照，用10μmol/L S ertraline HCl 处理HeLa 、MDA-MB231细胞48h 后，收集并裂解细胞，蛋白免疫印迹技术检测结果如图4所示．S ertraline HCl 处理后，HeLa 、MDA-MB231细胞中p62、组织蛋白酶B (Cathepsin B )表达均比对照组增加，差异有统计学意义．这表明S ertraline HCl 促进TFEB 靶基因p62、Cathepsin B 的表达．(a ) HeLa 细胞(b ) MDA-MB231细胞图4 Sertraline HCl 促进TFEB 靶基因的表达Fig. 4 Sertraline HCl promoting the expression of TFEBtarget genes2.5 Sertraline HCl 促进细胞自噬以上实验结果表明，Sertraline HCl 促进TFEB 入核并增强TFEB 的转录活性，而TFEB 调控很多溶酶体蛋白的表达．因此，进一步研究Sertraline HCl 对细胞自噬的作用．LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理为：无自噬时，EGFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，EGFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下可以观察到形成多个明亮的EGFP-LC3绿色荧光斑点，通过计数评价自噬活性的高低．将稳定表达EGFP-LC3的HeLa 细胞培养于96孔板中，常规培养24h 后加入S ertraline HCl (终浓度5μmol/L )，DMSO 为阴性对照，雷帕霉素(Rapamycin )(终浓度500nmol/L )为阳性对照．继续培养6h ，用4% PFA 室温固定15～20min ，弃去PFA ，PBS 洗3次，荧光显微镜下拍照观察EGFP-LC3点状分布．图5(a )结果显示，Sertraline HCl 处理后，EGFP-LC3绿色亮点聚集，而且数量比阴性对照增多，说明S ertraline HCl 能够增加LC3-Ⅱ蛋白的聚集程度，由此表明Sertraline HCl 促进HeLa 细胞自噬体的形成．DMSO Rapamycin Sertraline(a ) Sertraline HCl 促进HeLa 细胞自噬体的形成(b ) Sertraline HCl 促进HeLa 细胞中LC3-Ⅱ蛋白增加(c ) Sertraline HCl 促进MDA-MB231细胞中LC3-Ⅱ蛋白增加·26·天津科技大学学报第34卷第5期(d) Sertraline HCl促进游离EGFP蛋白增加图5Sertraline HCl促进细胞自噬Fig. 5Sertraline HCl promoting autophagy在自噬过程中，LC3在相关蛋白酶的作用下转变为具有活性的LC3-Ⅱ并结合到自噬体膜上，因此，LC3-Ⅱ蛋白水平直接反映自噬体数量．LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或LC3-Ⅱ/β-actin的比例与自噬体的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性[17-18]．因此，进一步研究了S ertraline HCl对LC3-Ⅱ蛋白表达的影响．将HeLa、MDA-MB231细胞培养于6孔板中，加入10μmol/L S ertraline HCl常规培养48h，DMSO作为对照，通过蛋白免疫印迹技术检测自噬标志物LC3的表达情况．结果如图5(b，c)所示，S ertraline HCl处理的HeLa、MDA-MB231细胞中LC3-Ⅱ蛋白水平明显高于对照组，表明S ertraline HCl能够上调HeLa、MDA-MB231细胞内自噬体数量．自噬体形成后会运送到溶酶体，与其融合形成自噬溶酶体，在自噬发生时，EGFP-LC3连同自噬体内膜和内容物一起被降解；但与LC3易被降解不同的是，EGFP在溶酶体中仅表现荧光信号淬灭，本身并不被降解，在自噬溶酶体降解后会释放出游离的EGFP[19-20]．因此，游离EGFP也可以作为检测自噬流降解是否发生的依据．通过蛋白免疫印迹技术检测不同终浓度的S ertraline HCl处理稳定表达EGFP-LC3的HeLa细胞12h后细胞中EGFP蛋白的变化，结果如图5(d)所示，随着药物浓度的增加，游离EGFP蛋白的数量增加，表明Sertraline HCl能够促进自噬流．2.6 Sertraline HCl抑制肿瘤细胞生长为了研究S ertraline HCl是否具有抗肿瘤活性，通过MTT法检测S ertraline HCl对肿瘤细胞活力的影响，结果如图6所示．(a) 不同浓度Sertraline HCl处理48 h后HeLa细胞的活力(b) 10 µmol/L Sertraline HCl不同处理时间HeLa细胞的活力(c) 不同浓度Sertraline HCl处理48 h后MDA-MB231细胞的活力(d) 10 µmol/L Sertraline HCl不同处理时间MDA-MB231细胞的活力图6Sertraline HCl对肿瘤细胞活力的影响Fig. 6Effect of Sertraline HCl on cancer cells viability2019年10月李 薇，等：稳定表达TFEB-GFP细胞系的构建及促TFEB入核药物筛选·27·S ertraline HCl在10μmol/L以上浓度时，HeLa、MDA-MB231细胞的活力均受到抑制，并呈浓度梯度依赖性；10μmol/L S ertraline HCl处理HeLa、MDA-MB231细胞48h时，细胞活力均出现了明显降低 (P＜0.01)，72h更明显(P＜0.001)，并呈时间梯度依赖性，表明Sertraline HCl抑制肿瘤细胞的活力．3 讨 论TFEB与人类疾病的发生存在相关性，它的激活对许多神经系统疾病和溶酶体疾病的治疗有潜在的作用．因此，以精确的时间和组织特异性方式调节TFEB活性的小分子化合物的开发具有很好的前景．这些小分子有潜力用于众多的人类疾病的治疗，包括肝细胞代谢调节、巨噬细胞炎症反应、肌肉线粒体功能以及神经元细胞清除等方面．TFEB参与细胞内清除的多个途径，TFEB可以作为治疗靶点用于治疗许多与自噬或溶酶体功能障碍有关的疾病和与有毒聚集物累积相关的疾病．研究证明调节TFEB的活性具有作为溶酶体疾病治疗策略的潜力，因为自噬/溶酶体途径的缺陷是这类疾病发病机制的重要原因[21-23]．因此，构建稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞系用于筛选和研究激活TFEB活性小分子化合物具有重要意义．本研究筛选到S ertraline HCl具有促进TFEB转录活性的作用．Sertraline HCl是选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)类的抗抑郁药[24]，主要用于治疗抑郁症、焦虑症、强迫症、恐慌症和创伤后应激障碍，还可用于早泄[25-26]、神经心源性晕厥[2]等疾病的治疗．S ertraline HCl也适合治疗包括患阿尔茨海默氏病(AD)在内的老年患者的抑郁症状[27]，控制AD患者出现的其他可能由血清素能系统介导的行为问题，如焦虑、易怒和攻击性等[28]．能够改善伴有抑郁症的稳定型慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者生活质量的疗效[29]，在治疗脑卒中后抑郁症[30]、糖尿病抑郁症[31]、冠心病介入术后抑郁症[32]、帕金森病后抑郁症[33]也显示了良好的临床效果．Sertraline HCl 对脑结构的改善与强迫症患者的症状改善有关，Tang 等[34]研究了S ertraline HCl对强迫症患者脑结构的影响，结果显示，用S ertraline HCl进行药物治疗12周后，有11例强迫症患者的灰质体积显著增加，小脑活化增加．目前，S ertraline HCl的抗抑郁疗效明显，但对肿瘤细胞的作用鲜有报道．本次实验利用高效且能稳定整合于宿主基因组的慢病毒载体构建了稳定表达TFEB-GFP的HeLa 细胞系，为研究TFEB在HeLa细胞中的功能及作用机制奠定了基础，该细胞系还为针对TFEB的靶向性研究提供了一种切实可行的细胞模型；同时利用该细胞模型筛选出了促TFEB入核药物Sertraline HCl，该药物能够促进TFEB靶基因的表达，并促进细胞自噬，具有抗肿瘤活性．自噬在肿瘤细胞中起着抵抗肿瘤组织微环境压力的作用，从而促进肿瘤细胞的生长．当细胞自噬处于一定的水平内，主要体现为促进肿瘤细胞存活的作用，但是也存在过度激活的自噬导致肿瘤细胞死亡的现象，这也是一个可能的抑瘤机制[35]．因此，可以推测Sertraline HCl可能通过过度激活细胞自噬引起肿瘤细胞的死亡．参考文献：［1］Steingrímsson E，Copeland N G，Jenkins N A. 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稳定表达点突变型DNA聚合酶β的细胞系的建立赵继敏;金戈;杨洪艳;赵国强;黄幼田;王涛;崔华娟;董子明【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2004(013)002【摘要】目的建立稳定表达点突变型DNA聚合酶β的细胞系.方法将已构建的点突变型DNA聚合酶β的真核表达载体用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞,经G418筛选后得到稳定转染的细胞株,用RT-PCR方法鉴定点突变型DNA聚合酶β mRNA水平的表达.结果与结论建立稳定表达DNA聚合酶β的细胞株,为进一步研究突变的DNA聚合酶β的功能变化奠定基础.【总页数】2页(P114-115)【作者】赵继敏;金戈;杨洪艳;赵国强;黄幼田;王涛;崔华娟;董子明【作者单位】450052,郑州,郑州大学医学院;450052,郑州,郑州大学医学院;450052,郑州,郑州大学医学院;450052,郑州,郑州大学医学院;450052,郑州,郑州大学医学院;450052,郑州,郑州大学医学院;450052,郑州,郑州大学医学院;450052,郑州,郑州大学医学院【正文语种】中文【中图分类】Q555【相关文献】1.稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立 [J], 祁光宇;刘学荣;刘萍;刘斌;王凡;武发菊;杜平;董金杰;黄银君;牟克斌2.稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系的建立 [J], 赵继敏;黄幼田;杨洪艳;金戈;郑智敏;董子明3.稳定表达缺失型DNA聚合酶β的CHO细胞系的建立 [J], 赵继敏;杨洪艳;赵国强;黄幼田;郑智敏;金戈;董子明4.稳定表达野生型和突变型DNA聚合酶β的NIH3 T3细胞系的建立及其生长特性 [J], 金戈;杨洪艳;赵继敏;黄幼田;郑智敏;赵国强;赵勤;吴景兰;董子明5.重组突变型 DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建 [J], 赵国强;刘栋;赵勤;杨洪艳;金戈;赵继敏;高丽;董子明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。