小鼠前列腺癌细胞 RM-1贴壁培养

・１２５４・　中国中医急症２０１１年８月第２０卷第８期　ＪＥＴＣＭ．Ａｕｇ．２０１１，Ｖｏ１．２０　１　！：　菊藻丸含药血清对人激素非依赖性前列腺癌　细胞增殖和周期的影响术　

杨邵波　刘海涛△　董树猛　贾贤军　刘　平　湖南中医药大学第二附属医院（湖南长沙４１０００５）　

中图分类号：Ｒ２８５．５文献标志码：Ａ文章编号：１００４—７４５Ｘ（２０１１）０８—１２５４—０３　【摘要】　目的探讨含菊藻丸大鼠血清对人激素非依赖性前列腺癌细胞系ＰＣ一３增殖和细胞周期的影响。方法　以３种不同质量浓度的菊藻丸水剂对成年雄性去势ＳＤ大鼠灌胃。另以等量生理盐水灌胃进行对照。末次灌胃　后于６０～９０ｍｉｎ时间段内取下腔静脉血制成血清，用以体外培养ＰＣ一３；用ＭＴｒ法测定培养４、２４、４８、７２ｈ的细　胞存活率。用流式细胞仪测定培养４８ｈ的细胞周期分布。结果高、中剂量的含药血清可抑制ＰＣ一３细胞的生　长，且抑制作用随时间的延长而增强，低剂量无明显抑制作用。含药血清高剂量组Ｇｌ—Ｇ０期细胞比例低于中、　低剂量组．Ｇ２／Ｍ期细胞比例高于中、低剂量组。结论含菊藻丸血清能抑制ＰＣ一３细胞增殖，可用于动物实验进　

一步明确体内有无抗肿瘤作用；不同质量浓度含药血清对细胞周期影响不同，机制有待研究。　【关键词】前列腺癌ＰＣ一３　中药复方细胞增殖细胞周期　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｊｕｚａｏ　Ｐｉｌｌｓ　ｏｎ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｈｏｒｍｏｎｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ　ＹＡＮＧ　Ｓｈａｏ－ｂｏ，ＬＩＵ　Ｈａｉ－ｔｏｏ，ＤＯＮＧ　Ｓｈｕ－ｍｅｎｇ，ｅｔ　Ｔｈｅ　ＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＨｕｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００８，Ｈｕｎａｎ）　

肿瘤细胞分离培养操作流程1.准备好动物试验台。

提供无菌环境当然是最好的。

2.将一个10cm培养皿（无菌）置入操作台中，用来盛放肿瘤，放在冰上。

3.麻醉小鼠。

推荐异氟烷，因为它对代谢的影响最小。

4.腹部向上将小鼠固定于工作平台上；胶带或大头针固定四肢。

为尽量减少因痛苦导致的麻醉动物过早苏醒，胶带是首选。

5.彻底清洁腹部和胸部区域，用乙醇或碘剂消毒。

此步骤既要求迅速又要求消毒彻底，因为动物的毛皮是第一个潜在的污染源。

如果动物有排便，一定要清理和消毒沾染粪便的区域。

（有文献建议断食12h）6.准备好所有必要的试剂。

7.主要实验材料：Defined K-SFM 无血清培养基、Ⅱ型胶原酶或胰蛋白酶、RPMI 1640、PBS，EGF（表皮生长因子）和bFGF（碱性成纤维生长因子），青霉素和链霉素以及两性霉素B（0.25 mg / ml）。

8.最好在无菌环境中分装胶原酶，轻柔涡旋，并在37℃环境下使胶原酶溶解30-60分钟。

注意，虽然胶原酶溶解迅速，充分溶解30分钟以上的胶原酶具有更加稳定的消化效率（基于细胞总产量）。

9.用含青霉素及链霉素的RPMI 1640反复冲洗并剔除坏死组织后，在培养皿内用无菌剪刀反复剪切成约1 mm 3 大小的组织块。

10.收集剪切后的肿瘤组织置于底面积为25 cm 2的培养瓶中，用含有Ⅱ型胶原酶200-400 U/mL的Defined K-SFM 无血清培养基在5%的CO 2培养箱中37 ℃消化2h-3 h后，当大多数组织变成细胞悬浮液时，酶消化停止。

倒置显微镜下观察大部分细胞为单个细胞。

11.用RPMI 1640洗涤，300g离心5min，1-3次彻底去除胶原酶。

收集消化后的肺癌细胞。

12.用含EGF 20 ng/mL、bFGF10 ng/mL 的Defined K-SFM培养基悬浮细胞并转移到25 cm 2的培养瓶中，在5%的CO 2培养箱中37 ℃培养，（有文献报道建议先用有血清培养4h后换成无血清培养基，以便保持细胞形态）。

3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞的影响黄马羊;宋涛;黎晓【摘要】目的:通过观察3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞增殖和相关基因表达的影响.方法:将前列腺癌细胞在培养基(含10%小牛血清)中采用开放式单层贴壁培养,采用MTT法对前列腺癌细胞的增殖情况进行分析,对3'-大豆苷元磺酸钠作用后的雄激素非依赖型前列腺癌细胞的存活率、细胞毒作用进行了研究.结果:与对照组相比,3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞抑制效应具有剂量依赖性,具有诱导前列腺癌细胞凋亡和引起坏死效应.同时诱导前列腺癌细胞的(PTEN基因)表达.结论:3'-大豆苷元磺酸钠具有明显抑制前列腺癌细胞增殖效应.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2010(030)003【总页数】2页(P337-338)【关键词】3'-大豆苷元磺酸钠;前列腺癌;PTEN基因【作者】黄马羊;宋涛;黎晓【作者单位】江西省胸科医院药剂科,江西,南昌,330006;赣南医学院,江西,赣州,341000;赣南医学院,江西,赣州,341000【正文语种】中文【中图分类】R965前列腺癌是一种同性激素相关的浸润性较强的男性恶性肿瘤,其发病率和死亡率都较高。

前列腺癌在转化为非激素依赖性前列腺癌后,目前无有效的治疗方法。

因此寻找有效和治疗前列腺癌的方法是一个急待解决的问题。

同时在前列腺癌发病和治疗的机制研究中,PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen)(MMACI/TEP)基因引起了广泛的注意,PTEN是新发现的位于染色体 10q23.3,具有酪氨酸磷酸酶活性的抑癌基因,目前认为 PTEN基因及其调节的Akt通路在前列腺癌的预防和治疗中具有重要作用[1]。

3'-大豆苷元磺酸钠(3'-daidzein sulfonate sodium,DSS)是中药葛根的主要有效成分大豆苷元进行结构修饰和改性的新合成的强水溶性物质[2]。

一、实验目的本研究旨在探讨小鼠肿瘤模型的构建及其在肿瘤研究中的应用。

通过建立小鼠肿瘤模型，模拟人类肿瘤的发生发展过程，为肿瘤的发病机制研究、药物筛选和疗效评价提供有力工具。

二、实验材料与设备1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，体重18-22g。

2. 细胞株：人肺腺癌细胞株A549。

3. 实验试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、DMEM培养基、DMEM-F12培养基、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、MTT细胞增殖检测试剂盒等。

4. 实验设备：细胞培养箱、倒置显微镜、CO2培养箱、酶标仪、流式细胞仪、超净工作台、离心机、高压蒸汽灭菌器等。

三、实验方法1. 细胞培养：将A549细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养，待细胞生长至对数生长期时用于实验。

2. 肿瘤细胞接种：取对数生长期的A549细胞，用胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL，接种于C57BL/6小鼠的右腋下。

3. 肿瘤模型观察：定期观察小鼠的生长状况，测量肿瘤体积，计算肿瘤生长速率。

4. 肿瘤细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测肿瘤细胞凋亡情况。

5. 肿瘤细胞增殖检测：采用MTT细胞增殖检测试剂盒检测肿瘤细胞增殖情况。

6. 流式细胞术检测：采用流式细胞术检测肿瘤细胞的表型。

四、实验结果1. 肿瘤模型构建：接种A549细胞后，小鼠右腋下出现肿瘤，肿瘤生长迅速，符合小鼠肿瘤模型的特点。

2. 肿瘤体积变化：随时间推移，肿瘤体积逐渐增大，肿瘤生长速率呈指数增长。

3. 肿瘤细胞凋亡：Annexin V-FITC/PI检测结果显示，肿瘤细胞凋亡率较低，提示肿瘤细胞具有较强的抗凋亡能力。

4. 肿瘤细胞增殖：MTT检测结果显示，肿瘤细胞增殖活性较高，提示肿瘤细胞具有较强的增殖能力。

5. 肿瘤细胞表型：流式细胞术检测结果显示，肿瘤细胞表面表达E-cadherin、Vimentin等蛋白，符合肿瘤细胞表型的特点。

小鼠诱导型多能干细胞OSKM -1说明书SCSP number: SCSP-1201细胞名称: OSKM-1细胞描述: 小鼠诱导型多能干细胞小鼠品系: C57BL/6，Oct4-EGFP转基因小鼠重编程转录因子：Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc细胞来源: 中科院上海生命科学研究院生化细胞所李劲松研究组SCSP 培养液: 小鼠iPS完全培养液：SCSP-618DMEM（invitrogen 12430）485 mlES级FBS（biochrom S0415）90 mlGlutamax（invitrogen 35050） 6 mlNEAA（invitrogen 11140） 6 mlNucleosides（Millipore ES-008-D） 6 mlLIF（Millipore ESG1107）60 ulβ-Mer（invitrogen 21985） 1.5 mlPS (Millipore TMS-AB2-C) 6 ml细胞说明: 小鼠诱导型多能干细胞（iPS），带GFP基因细胞总数/每支: 106体积/每支: 500µl传代方法:提前24h准备MEF细胞：事先包被0.2%明胶，按106/T25的量铺MEF细胞，使用10%DMEM。

待接种上mES细胞后更换为mES完全培养液。

传代周期：3-4天传代比例：1：4—1：7 换液频率：每天气相：空气，95%；二氧化碳，5%。

温度：37℃冻存液：培养液80%，FBS10%，DMSO 10%References: Jiang, J., Lv, W., Ye, X., Wang, L., Zhang, M., Yang, H., Okuka, M., Zhou, C., Zhang, X., Liu, L., et al. Zscan4 promotes genomicstability during eprogramming and dramatically improves thequality of iPS cells as demonstrated by tetraploidcomplementation. Cell research. 2013 Jan;23(1):92-106。

OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法贴壁细胞培养是一种常用的细胞培养方法，其中OPTIMEM是一种用于培养特定类型细胞的培养基。

下面将详细介绍使用OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法。

实验材料和仪器：1.贴壁细胞系：例如，HEK293细胞或NIH/3T3细胞等。

2. 细胞培养培养基：例如，Dulbecco修改的Eagle培养基（DMEM）或Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI 1640）。

3.OPTIMEM培养基。

4.烧杯和离心管。

5.无菌培养皿。

6.无菌培养壶。

7.显微镜。

8.离心机。

9.生物安全柜。

10.细胞移液器和离心管。

11.无菌培养室。

实验步骤：1.贴壁细胞的准备a.预先处理细胞培养器皿，将其在生物安全柜中用70％乙醇消毒，并用无菌PBS洗涤2次。

b.从细胞培养器皿中收集细胞，可以使用三文鱼糖蛋白酶或胰蛋白酶来消化细胞。

将细胞悬浮在培养基中，并利用细胞计数板在显微镜下计数细胞数。

c.获得所需数量的细胞，通常为1×106细胞/毫升。

d.用无菌PBS洗涤细胞2次并将其重悬于OPTIMEM培养基中，使细胞的最终浓度为1×105细胞/毫升。

e.获取无菌培养皿，将细胞悬浮液转移到培养皿中。

f.将培养皿放入无菌培养室，并将其放入培养箱中进行培养。

2.细胞培养和观察a.将培养皿放入培养箱中，在37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养细胞。

b.每天观察细胞的生长情况和形态学特征。

使用显微镜定期检查细胞的形态和密度。

c.检查细胞的污染和部分剥离，如果有必要，及时更换培养基。

3.细胞传代a.当细胞达到80-90％的密度时，用无菌PBS洗涤培养皿。

用胰蛋白酶消化细胞。

注意避免过度消化引起细胞死亡。

b.离心细胞悬浮液，去除上清液。

c.用新的OPTIMEM培养基将细胞悬浮，将细胞转移至新的无菌培养皿中。

d.将培养皿放入培养箱中进行培养。