茚三酮比色法测定水中微量氨含量

植物组织氨基酸含量的测定（改良的茚三酮比色法）一、实验原理植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成氨，前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白质。

测定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的茚三酮比色法。

α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的α-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。

根据蓝紫色的深浅，在580nm波长下测定吸光值。

本实验中在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不稳定性。

二、仪器设备研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴锅、可见分光光度计三、试剂1. 10%醋酸(100mL)2. 1% 抗坏血酸（100mL）3. 5μg/mL 亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至1000mL）4. pH5.4醋酸缓冲液：8.8mL 0.2mol/L 醋酸（冰醋酸11.55mL稀释至1000mL）加41.2mL 0.2mol/L醋酸钠（醋酸钠16.4g或三水醋酸钠27.2g 配成1000mL）。

5.水合茚三酮试剂：1.1g茚三酮放到烧杯中，加入15mL正丙醇，摇匀，溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀，再加9mL pH5.4醋酸缓冲液，混匀。

保存于棕色瓶中，冰箱保存，适用期限10天。

四、操作步骤1. 标准曲线的绘制以下表所示量从5μg/mL 亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并在每个试管中加蒸馏水至2mL，对照仅加2mL 蒸馏水，后在各试管中加入3mL 水合茚三酮试剂和0.1mL 1%抗坏血酸，摇匀。

盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分钟。

冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，在波长580nm 处测吸光值，以氨态氮浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

试管号 1 2 3 4 5 6 7试剂（mL） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 1.8氨态氮浓度 0 0.5 1 2 3 4 5 （μg/mL）2.称取0.5g 新鲜植物材料，放入研钵中，加入5mL 10%醋酸，研磨后以蒸馏水稀释至100mL ，混匀，通过滤纸过滤，弃去最先滤下的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。

茶叶中游离氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定茶叶中游离氨基酸总量，了解茶叶的品质和营养价值，为茶叶的生产、加工和质量控制提供科学依据。

二、实验原理茶叶中的游离氨基酸在一定条件下与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。

通过比色法测定反应液在特定波长下的吸光度，与标准曲线对照，即可计算出茶叶中游离氨基酸的总量。

三、实验材料与仪器1、实验材料茶叶样品：选取不同品种、不同产地的茶叶若干。

标准氨基酸溶液：精确配制一定浓度的谷氨酸标准溶液。

茚三酮试剂：称取适量茚三酮，用乙醇溶解并定容。

缓冲溶液：磷酸缓冲液（pH 80）。

2、实验仪器分光光度计分析天平恒温水浴锅容量瓶、移液管、比色皿等玻璃仪器四、实验步骤1、样品处理称取一定量的茶叶样品，用研钵研碎后，置于具塞三角瓶中。

加入适量的沸水，在水浴中浸提一定时间，冷却后过滤，滤液即为待测液。

2、标准曲线的绘制分别吸取不同体积的标准氨基酸溶液于一系列容量瓶中，加入缓冲溶液和茚三酮试剂，定容后摇匀。

将上述溶液置于沸水浴中加热一定时间，取出冷却至室温。

以空白溶液为参比，在分光光度计上于特定波长处测定吸光度。

以氨基酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3、样品测定吸取适量的待测液于容量瓶中，按照绘制标准曲线的步骤加入缓冲溶液和茚三酮试剂，定容、加热、冷却。

测定样品溶液的吸光度，根据标准曲线计算出游离氨基酸的含量。

五、实验结果与分析1、实验数据记录标准曲线测定数据：记录不同浓度标准氨基酸溶液的吸光度值。

样品测定数据：记录样品溶液的吸光度值及对应的计算结果。

2、结果计算根据标准曲线方程，计算样品中游离氨基酸的浓度。

按照样品处理时的稀释倍数，计算茶叶中游离氨基酸的总量。

3、结果分析比较不同茶叶样品中游离氨基酸总量的差异，分析可能的原因，如茶叶品种、生长环境、加工工艺等。

讨论实验过程中可能存在的误差来源，如样品处理的均匀性、反应条件的控制、仪器的精度等，并提出改进措施。

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。