基因工程第三章2-Jun-finalversion

1) 除去多余的限制酶识别位点 –天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如： EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切 位点必须被修饰。 –一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的 λ品系。 –自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠 杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限 制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突 变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。
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噬菌体的结构
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• 烈性噬菌体 • 温和噬菌体 • 溶源化细菌 • 溶源化 • 原噬菌体
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噬菌体的侵染与包装
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二、λ噬菌体载体
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λ噬菌体的电子显微镜照片
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（一） λ DNA分子
1.λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)，编 码50多个基因，在两端各有12个碱基组成的5’单链 互补粘性末端(Cohesive end),进入宿主细胞后,粘 性末端连接形成环状分子(Cos位点)，是包装的必需 DNA序列．
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2. λ噬菌体的改造
3) 引入无义突变
–琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG
（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有 特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能 专一性地纠正这一突变。
–将野生型λDNA上D和E两个头部包装蛋白的 基 因 中 的 CAG 密 码 子 突 变 成 UAG 。 当 这 种 λ DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成 有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解 细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污 染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则 是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 26
• 原噬菌体的删除作用
–整合作用需要int基因的表达，是一种可逆的过 程：一方面，噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌 染色体DNA上，成为原噬菌体；另一方面，在适 当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主染色体，重 新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的 删除作用。
–λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和int基因
的协同作用才能实现。
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4. λ噬菌体的组装
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（二） λ噬菌体载体的构建
1. 野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆载体 原因 –λDNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点， 不利于外源DNA插入—体内突变和建立新的克隆 位点。 –包装限制: λ噬菌体头部只能容纳自身DNA的 75-105%，即39-52.5 Kb，天然λ仅可插入2.5Kb 外源DNA片段—如若除去所有与λ裂解无关的基 因和空白区，最大可插入22 Kb。
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2. λ噬菌体的改造
➢ 切除非必需区段（重组基因簇）:1/3 非必需区段 ➢ 切除必需的的RE识别位点，在非必需区引入合适的
RE识别位点 ➢ 引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选 ➢ 建立重组λDNA分子的体外包装系统，通过无意义
突变将其改造成安全载体，以利于生物学防护。
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2. λ噬菌体的改造
–cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。
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λ
DNA
噬 菌 体 的 复 制
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• 溶原性周期 –λDNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到 宿主染色体上并随之一起复制。 –cI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因 被阻遏的蛋白质。 –附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源 位点之间的重组反应实现。
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通过自然选 择法筛选无 EcoRI识别 位点的λ噬菌体
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2. λ噬菌体的改造
2) 切除掉λDNA的非必需区 –载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需 区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、 HindIII、或salI），两者间的距离为14kb 长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长 的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 –40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载 装下限为10.4而上限为25.5kb。 –不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只 有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体 细胞中去
第三章 基因工程载体
Cloning Vectors
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第三章 基因克隆载体
第一节 质粒载体 第二节 噬菌体载体 第三节 真核细胞的克隆载体
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第二节 噬菌体载体
• 一、噬菌体的一般生物学特性 • 二、λ噬菌体载体 • 三、粘性质粒 • 四、单链DNA噬菌体载体
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一、噬菌体的一般生物学特性
噬菌体是比细菌还小 得多的微生物”。 它本身是一种核蛋白，核 心是一段DNA，结构上有 一个蛋白质外壳和尾巴， 尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’ b) λ基因组DNA上有56种限制酶识别位点．
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2. λ基因组DNA的结构 λ噬菌体基因大致分为4个区： 结构区A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,
重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis
制).Red,Xis,Int转录和 整合。 Q(晚期调控)促头, 尾,S,R基因表达和溶 菌 CI,CII,CIII为负调控， 阻止溶菌
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• 人为将λ噬菌体基因组分为3个区域：
–左侧区：自基因A到基因J，包含外壳蛋白的 全部编码基因。
–中间区：介于基因J和基因N之间，这个区又 称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源 DNA片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。 中间区包含重组基因和整合切割基因。
–右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要 调节基因及复制基因和裂解基因。
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3. λDNA的复制 • 裂解周期
–早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复 制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白 的参与。
–晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从 θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA 线性排列的多聚体分子。
（excission），调控区启动子、终止子和NCI基因， O-R 为裂解区.
λ噬菌体的基因组图及EcoRI酶切图 13
环化后的λ基因组DNA
A：成熟包被，切开 cos环，
D,E：(占头蛋白75%) W,F：头尾连接 Int(整合),Xis(删
除),Red促重组 N(早期调控)促O,P(复