基因工程第三章基因工程载体
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三、粘性质粒
粘性质粒是带有λ噬菌体的Cos位点和整个pBR322的 DNA序列的载体。
1. 粘性质粒பைடு நூலகம்组成及性质
粘性质粒（Cosmid）带有 λ噬菌体的Cos位点和整个 pBR322的DNA顺序。经感染进 入细菌细胞以后，它就好象质 粒那样在细胞中进行复制。易 环化和扩增。分子量小，可包 装30-45kb外源基因，菌体 • 温和噬菌体 • 溶源化细菌 • 溶源化 • 原噬菌体
噬菌体的侵染与包装
二、λ噬菌体载体
λ噬菌体的电子显微镜照片
（一） λ DNA分子
1.λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)，编 码50多个基因，在两端各有12个碱基组成的5’单链 互补粘性末端(Cohesive end),进入宿主细胞后,粘 性末端连接形成环状分子(Cos位点)，是包装的必需 DNA序列．
–右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要 调节基因及复制基因和裂解基因。
3. λDNA的复制
• 裂解周期 –早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复 制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白 的参与。 –晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从 θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA 线性排列的多聚体分子。 –cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。
左臂
右臂
cos位点
置换区域
cos位点
λNM781 由于λ噬菌体的感染，
寄主细胞lacZ基因的琥珀突 变被抑制,所以能在乳糖麦康 基氏(McConkey)琼脂培养基 上产生红色的噬菌斑,或是在 X-gal琼脂培养基上产生蓝色 的噬菌斑。但如果具有supE 基因的EcoRⅠ片段被外源DNA 所取代，那么形成的重组体 噬菌体在上述的两种指示培 养基中都只能产生出无色的 噬菌斑。应用指示性培养基 可对这种重组体方便的筛选 出来。
基因工程-载体
分别转化E.coli (ApS TcS)
涂布Ap平板 涂布Tc平板
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
状的，则质粒仍然能进行复制。 将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后， 该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建 的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。
复制的起始区：能在宿主细胞内进行独立和稳 定的自我复制。
选择标记基因区：可以筛选重组体。
多克隆位点：方便外源基因的插入。
第一节 质粒载体
广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
质粒
染色体
质粒的一般生物学特性： 分子大小差异大：1—200 kb 编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细 菌一些额外的特性（非必须）。
质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性, 又称质粒的不亲和性。
质粒的复制过程
质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型
复制为主。在θ型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。
θ型复制
Ori复制起点
第三章基因工程载体
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
《基因工程》第三章 载体2
Induction
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
第三章 第一节 基因工程（基因表达载体的构建）
4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列 操作与实验目的不符的是（ C ）
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
三、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的内容、方法
阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺 少的内容。
检测水平
分子水 DNA 平的检 RNA
测 蛋白质 个体水平的检测
检测内容
方法
结果显示
1．检测与鉴定的内容、方法
检测水平
检测内容
方法
结果显示
检测转基因生物的染色体 DNA分子杂交法（基因探针
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全 能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但 又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有 多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质 时比大肠杆菌有优势。 有内质网和高尔基体
2．病毒感染法 用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞， 也能使目的基因导入动物细胞内。
（三）将目的基因导入微生物细胞 1．感受态细胞 经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会
发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 感受态细胞。
2．过程
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
第三章 基因克隆载体 基因工程课件
3.1.3.1 不同类型的质粒载体
• 高拷贝的质粒载体
克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因
• 低拷贝的质粒载体
有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰 寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白 质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编 码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因 等。
3.1 质粒克隆载体
是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，主要用于建克隆载体相关的质粒性质：
3.1.1.1 质粒的构型 3.1.1.2 质粒DNA分子大小 3.1.1.3 质粒DNA分子的复制 3.1.1.4 质粒DNA的不亲和性 3.1.1.5 质粒迁移 3.1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒
•
正选择的质粒载体
正向选择： 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养 条件进行选择。这种质粒载体具有直接选 择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。
Example：
质粒pKN80有来自Mu噬菌 体DNA的EcoRI-C的片 断，编码一种致死功能 的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源 菌株中正常复制；在非 溶源菌株中是致死的。 在Hind III 或Hpa I位点插入 外源DNA片断后，会产 生具Ampr表型的Mu噬菌 体的非溶源的转化子菌 株。
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含 有一个EcoR V酶切位点，一个四环素抗性 选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影 响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷 贝数低，只具有一种抗菌素抗性基因，无 法使用插入失活技术选择重组分子。
（4363bp）
以Ampr和 Tetr为选择 性标记， 克隆位点 在这两个 选择性标 记的单酶 切位点上。 选择 AmprTets 或 AmpsTetr 的重组子。
第三节 载体
细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒保持完整 的状态； （3）染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的 碱基中，导致链的解旋；形成的EB- DNA复合物 中，EB含量越高，密度会越低。
B：流程
2.碱变性法
A：原理： （1）pH 12.0-12.6：线性DNA变性，质粒DNA为
自然状态； （2）pH中性，高浓度盐：线性DNA交联成不溶网
3、载体的分类
根据来源：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体 根据用途：克隆载体、表达载体 常用的载体： 质粒（plasmid）、单链DNA噬菌体 M13 、噬菌体的衍生物、柯斯质粒（cosmid）、 动物病毒（virus）
常见载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 结构
E.coli
环状
λ 噬菌体
E.coli
（三 ） 质粒DNA的分离与纯化
1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、沸水浴法
细菌DNA提取的步骤
• 1） 细菌培养物的生长和收集 • 2） 细胞破碎以获得细胞提取物 • 3） 从细胞提取物中纯化DNA • 4） DNA浓缩
1.氯化铯密度梯度离心法
A：原理 （1）质粒占总DNA1%～2%； （2）在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的
醇沉淀收集质粒DNA。
3、沸水浴法
用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，取上清，加异丙醇，离心 乙醇沉淀质粒DNA
三 、噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
状结构，SDS作用下形成沉淀；质粒DNA仍为可 溶状态。离心，上清质粒DNA （3）纯化：乙醇沉淀
B：步骤
（1）菌体培养与提取； （2）裂解细胞：煮沸法、碱性SDS法，非离子型去污
B：流程
2.碱变性法
A：原理： （1）pH 12.0-12.6：线性DNA变性，质粒DNA为
自然状态； （2）pH中性，高浓度盐：线性DNA交联成不溶网
3、载体的分类
根据来源：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体 根据用途：克隆载体、表达载体 常用的载体： 质粒（plasmid）、单链DNA噬菌体 M13 、噬菌体的衍生物、柯斯质粒（cosmid）、 动物病毒（virus）
常见载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 结构
E.coli
环状
λ 噬菌体
E.coli
（三 ） 质粒DNA的分离与纯化
1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、沸水浴法
细菌DNA提取的步骤
• 1） 细菌培养物的生长和收集 • 2） 细胞破碎以获得细胞提取物 • 3） 从细胞提取物中纯化DNA • 4） DNA浓缩
1.氯化铯密度梯度离心法
A：原理 （1）质粒占总DNA1%～2%； （2）在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的
醇沉淀收集质粒DNA。
3、沸水浴法
用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，取上清，加异丙醇，离心 乙醇沉淀质粒DNA
三 、噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
状结构，SDS作用下形成沉淀；质粒DNA仍为可 溶状态。离心，上清质粒DNA （3）纯化：乙醇沉淀
B：步骤
（1）菌体培养与提取； （2）裂解细胞：煮沸法、碱性SDS法，非离子型去污
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
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2021/3/2
基因工程第三章基因工程载体
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的 氯霉素不能结合在核糖体上。
如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977,
Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆
位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不
同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体， 表达型载体及各种探针型载体。
7）荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧 光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌
（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化
还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
8）发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠 杆菌菌落呈蓝色。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因
Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和 Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细 胞内。
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1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合
位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
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基因工程第三章基因工程载体
遗传标记基因
1. 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主 细胞
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基因工程第三章基因工程载体
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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基因工程第三章基因工程载体
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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基因工程第三章基因工程载体
6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛， 因为许多生物中没有这种基因。
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非 选择性的（如lacZ）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
* 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的 （如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。
**有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用 时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采 用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择 性标记基因（lacZ，GUS等）。
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基 因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3， LEU2，HIS4等。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT
4） 噬菌斑
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基因工程第三章基因工程载体
3. 使用标记基因注意要点
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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基因工程第三章基因工程载体
发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因工程第三章基因工程载体
分子克隆载体的复制起点与种类
1. 复制起点的种类
1) 核内复制起点
a. 染色体复制起点—原核生物(环状)和真核生物(线状)染色体
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质 分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一 种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子 进入细菌细胞。
基因工程第三章基因工程载体
5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性， 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。 前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者 都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两 个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称 之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可 作为标记基因。
2021/3/2
基因工程第三章基因工程载体
2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ， Neor
b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）