基因工程-基因工程载体解析
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基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
基因工程载体名词解释
基因工程载体是指能将分离或合成的基因导入细胞DNA分子，并在其中得以维持的DNA分子。
这些载体通常具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并保持其稳定性和表达。
基因工程载体的类型包括质粒DNA、病毒DNA和科斯质粒等。
其中，质粒是一种小型环状DNA分子，可以自我复制，并能够在细菌细胞中稳定存在。
病毒DNA则是一种感染细胞的病毒，其基因组可以插入外源基因并携带其进入细胞。
科斯质粒则是一种人工合成的质粒，具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并维持其稳定性和表达。
在基因工程操作中，载体被用来将外源基因导入受体细胞，并在其中表达。
通过使用载体，研究人员可以更容易地操作和调控基因的表达，从而更好地了解基因的功能和作用机制，为疾病治疗、药物研发等提供重要的支持。
第三章基因工程载体
16
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
基因工程第五章-载体
第一个经改造的认为 较完善的质粒载体是 pBR313, 他是松弛型 载体，引入了两个标 记基因------抗四环素 基因Tecr和抗青霉素 基因Ampr, 他的外源 基因插入位点在两个 抗性基因中
质粒的序列含有必要区和非必要区。
必要区指的是与质粒DNA复制有关的基因，他们对 质粒的存活、复制极为重要。
❖ 对于天然质粒来说，他们的基因中含有控制质粒分配的功能 区，细胞分裂构成中，这个功能区保证质粒拷贝被平均分配。
❖ 人工构建的质粒这个功能区已经缺失，因此，它在细胞分 裂中是随机分配的，尽管出现无质粒的细胞的几率较低，但 在一定的条件下，比如――－细胞分裂较快或营养缺乏的情 况下，会出现无质粒的细胞。
❖ COL质粒：1952年发现的大肠杆菌含有这一因子可编码一种奇 怪的蛋白质抗菌物质――大肠菌素。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
3. 引入多种用途的辅助序列，构建具有特化功能的载体：
构建质粒可用于组织化学方法的鉴定：pUC18载体带有 一个Lac操纵子的DNA区段，宿主细胞具有与之互补的基 因，当质粒进入宿主后，由于互补作用，而实现β－半乳 糖苷酶的表达（诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与操作 子脱离）。外源基因的插入会导致基因失活而检查重组子。
Section one
plasmids
一、质粒的生物学特性：
❖ 质粒最初发现于细菌中，是染色体外能自主复制的双 链共价闭合的环状DNA分子，是能够进行独立复制并 保持遗传恒定的复制子，大小在1――200KB。质粒 常含有一些编码对细菌生存有利的基因，比如说抗性 基因，降解复杂有机物的酶、细菌素，并且可赋予微 生物特殊的外形―――鞭毛、菌毛、芽孢等。
《基因工程》第三章 载体2
Induction
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
4基因工程-载体
4．质粒是基因工程的常用载体，下列关于它的说法正确的是( D )
A．具有环状结构的染色体，能够携带目的基因 DNA B．含蛋白质，从而能完成生命活动 C．是 RNA，能够指导蛋白质的合成 D．能够自我复制，从而保持连续性
—CTTAAG—
—G —CTTAA
EcoR I切点
AATTC— G—
碱基互补配对
(2)DNA 连接酶是基因操作的“分子缝合针”，其作用是把基于________
能力而黏合在一起但存在的切口封闭，进而才可能形成有意义的__重__组__D_N_A。 (某些)病毒
(3)逆转录酶也常被用于基因工程，其存在于________(生物)中，催化以
___m_R_N_A__为模板合成 DNA 的过程。
某些生化表型基因
在质粒作为载体时其上必须有至少一个标记基因存在。 即：限制酶切割位点不能破坏全部标记基因
a,b,c为酶切位点， a,c为限制酶Ⅰ切割位点；b为限制酶Ⅱ切割位点， （限制酶Ⅰ能切开限制酶Ⅱ的序列，限制酶Ⅱ不能切
开限制酶Ⅰ的序列） 选限制酶Ⅱ
则应选那种限制酶？ 含有该质粒的细胞将来在什么培养基上能存活？ 在什么培养基不能存活？
B．①④⑥
C．①③⑥⑦
D．②③⑥⑦
类型二 质粒结构和功能 例 2►目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基 础重新组建的人工质粒，pBR322 质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下 图所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_筛___选__(_鉴__别___)目___的__基___因__是_______ _____________________________________否__导___入__受__体___细__胞__________。
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)
(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分
子结构，即cccDNA； 质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。
D-DNA ocDNA cccDNA
但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅 速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变 性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。
沸水浴法 用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟； 离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；
λ噬菌体生物学特性：溶原状态
➢λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也 可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上， 并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态； ➢整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质； ➢人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质， 使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；
4363 bp
ROI
➢用于基因克隆
ROP Origin of Replication Hind II
Sal I Bal I
pUC18/19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
➢分子量2686bp； GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
基因工程的载体和受体情况讲解
但这种对应关系不是绝对的，若细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉 素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其 数量可达数千拷贝。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
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1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起 始序列, 密码子偏爱性 4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一 种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基 因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四 环素分子进入细菌细胞。
pUC18
外源DNA
BamHI片段
重组DNA分子 转化E.coli
BamHI片段
利用LacZ基因筛选重组子
2018/10/10 苏州科技学院生物系 叶亚新
涂布在含X-Gal 和Ap的平板上, 白色菌落为重组 子，兰色菌落为 原载体
6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水 解酶。该标记基因除具有上述l中没有这种基因。
苏州科技学院生物系
叶亚新
5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活 性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和
β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有
当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作 用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编 码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和 LacZα）均可作为标记基因。
2018/10/10
苏州科技学院生物系
叶亚新
2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r， Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体 •酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体
2018/10/10
苏州科技学院生物系
叶亚新
发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
2018/10/10
苏州科技学院生物系
叶亚新
LacZ基因的结构与产物
P LacZα LacZβ 转录 翻译
α
β
2018/10/10
苏州科技学院生物系
叶亚新
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。 Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺 环的水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合 成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化 的氯霉素不能结合在核糖体上。
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶 类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1， URA3，LEU2，HIS4等。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT
4） 噬菌斑
2018/10/10 苏州科技学院生物系 叶亚新
3. 使用标记基因注意要点
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移 性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整 合位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
2018/10/10 苏州科技学院生物系 叶亚新
遗传标记基因
1. 标记基因的作用
如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar
et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克
隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不
同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因
Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子 Tn5和 Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞 内。
2018/10/10
达型载体及各种探针型载体。
2018/10/10
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞
2. 为外源基因提供复制能力或整合能力
3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
2018/10/10
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叶亚新
第三章 基因工程的载体
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主 细胞
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可 以是非选择性的（如lacZ）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
* 这种指示也可以是选择性的（如Tcr），也可以是非选 择性的（如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一 作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前 多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作 选择性标记基因（lacZ，GUS等）。
7）荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产 生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细 菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化 还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一 种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基 因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四 环素分子进入细菌细胞。
pUC18
外源DNA
BamHI片段
重组DNA分子 转化E.coli
BamHI片段
利用LacZ基因筛选重组子
2018/10/10 苏州科技学院生物系 叶亚新
涂布在含X-Gal 和Ap的平板上, 白色菌落为重组 子，兰色菌落为 原载体
6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水 解酶。该标记基因除具有上述l中没有这种基因。
苏州科技学院生物系
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5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活 性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和
β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有
当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作 用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编 码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和 LacZα）均可作为标记基因。
2018/10/10
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2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r， Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体 •酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体
2018/10/10
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
2018/10/10
苏州科技学院生物系
叶亚新
LacZ基因的结构与产物
P LacZα LacZβ 转录 翻译
α
β
2018/10/10
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。 Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺 环的水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合 成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化 的氯霉素不能结合在核糖体上。
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶 类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1， URA3，LEU2，HIS4等。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT
4） 噬菌斑
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3. 使用标记基因注意要点
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移 性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整 合位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
2018/10/10 苏州科技学院生物系 叶亚新
遗传标记基因
1. 标记基因的作用
如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar
et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克
隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不
同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因
Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子 Tn5和 Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞 内。
2018/10/10
达型载体及各种探针型载体。
2018/10/10
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叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞
2. 为外源基因提供复制能力或整合能力
3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
2018/10/10
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主 细胞
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可 以是非选择性的（如lacZ）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
* 这种指示也可以是选择性的（如Tcr），也可以是非选 择性的（如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一 作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前 多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作 选择性标记基因（lacZ，GUS等）。
7）荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产 生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细 菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化 还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。