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工程菌β-胡萝卜素累积及提取条件优化的研究冯亦平;李珍;王健梅【摘要】以大肠杆菌为工程菌,针对β-胡萝卜素的累积和提取两大方面,研究了不同IPTG诱导时间及浓度、菌液OD值、盐酸用量、破壁时间及温度、丙酮用量、抽提时间8个条件对β-胡萝卜素累积及提取的影响,并用分光光度计测定不同条件下工程菌积累的β-胡萝卜素的吸光度值,从而筛选适合β-胡萝卜素高效累积及提取的最佳培养条件.结果表明,当诱导时间为1.25 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,菌液OD值为0.6,HCl量为15 mL/g(湿菌体),破壁时间为40 min,破壁温度为40℃,丙酮量为20 mL/g(湿菌体),抽提时间为0.5h时,β-胡萝卜素的提取量达到最大.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2010(038)004【总页数】4页(P21-24)【关键词】β-胡萝卜素;工程菌;累积;提取【作者】冯亦平;李珍;王健梅【作者单位】山西农业大学,山西,太谷,030801;长治职业技术学院园艺系,山西,长治,046000;长治职业技术学院园艺系,山西,长治,046000【正文语种】中文【中图分类】TS202.3类胡萝卜素（carotenoids）是一类呈现黄色、橙色或红色的植物色素，广泛存在于各种动植物和微生物中。
许多类胡萝卜素是VA的重要来源，同时又是强抗氧化剂，具有一定的防癌功效[1～3]。
其中，β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表。
它的分子式为C40H56，分子质量为536.85[4]，易溶于二硫化碳（0.02g/mL）、沸腾乙醚（0.33 g/L）、正己烷（0.07 g/L），溶于氯仿和苯，微溶于乙醇和甲醇，不溶于水，无毒[5]。
β-胡萝卜素是一种比较昂贵的天然色素[6]，是目前国际市场上颇受欢迎的产品，具有广阔的市场前景。
传统提取β-胡萝卜素的方法是将新鲜胡萝卜绞汁以后，倒入高压均质机中均质，然后加入沉淀剂CaCl2·2H2O和稳定剂氨水/乙醇，离心，弃上清液，得到橙红色沉淀[7]；然后将沉淀冷冻干燥，得到粉末状干燥沉淀，并在沉淀中加入有机溶剂石油醚萃取β-胡萝卜素[8]，之后旋转蒸发浓缩，回收有机溶剂后得到β-胡萝卜素油状物。
番茄类胡萝卜素的研究姜娜娜1,2,李长生2,王绛辉3,毕玉平2,王兴军2*(1.山东师范大学生命科学学院,山东济南250014;2.山东省农业科学院高新技术研究中心,山东省作物与畜禽品种改良重点实验室,山东济南250100;3.山东省农业科学院国际合作处,山东济南250100)摘要综述了类胡萝卜素的理化特性、生理作用、生物合成途径及其近年来人们利用基因工程途径提高番茄中类胡萝卜素的方法,最后对这一领域的研究前景作了展望。
关键词类胡萝卜素;番茄;基因工程中图分类号Q789文献标识码 A 文章编号0517-6611(2007)34-10979-02类胡萝卜素(C a roten oid)是一类天然色素的总称,属于类萜化合物,普遍存在于动物、植物、真菌、藻类和细菌中,其化学结构主要是β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素。
类胡萝卜素在医药保健品、精细化工行业以及饲料行业都有大量的原料需求。
1类胡萝卜素的理化特性类胡萝卜素是自然界中最大的一类色素。
截至20世纪末,人们已发现600多种类胡萝卜素。
类胡萝卜素主要存在于黄色、红色的花、果实和蔬菜中。
除八氢番茄红素、六氢番茄红素等类胡萝卜素无色外,绝大多数类胡萝卜素呈现黄色、橙色或红色。
类胡萝卜素是高度不饱和化合物(多烯),含有一系列共轭双键和甲基支链。
类胡萝卜素分子中最重要的部分是决定颜色和生物功能的共轭双键系统[1]。
色素的颜色随着共轭双键的数目而变动。
共轭双键的数目越多,则颜色离红色越远。
2类胡萝卜素的生理作用类胡萝卜素对植物本身有重要作用。
在叶绿体中,类胡萝卜素参与光合膜上的光捕捉。
它们在植物中是一种强抗氧化剂,可以淬灭超氧自由基和单态氧离子[2-3]。
同时,它们也是色素-蛋白复合体的重要组成部分,是植物激素脱落酸的前体[4]。
类胡萝卜素不仅是植物体内的功能性分子,在动物和人类健康中也发挥重要作用。
越来越多的研究表明,食用富含类胡萝卜素的食物可减少与老化有关的疾病如冠心病(C o ron a ry h ea rt d isea s e)、黄斑(m a cu la r)退化疾病以及某些癌症的发病率。
番茄红素的理化性质及其生产方法的研究进展王华;朱中艳;陶美玲;沈敏;乔慧;王璐;胡仁和【摘要】综述了近年来国内外番茄红素的生产方法和研究现状,展望了番茄红素生产的发展方向,认为通过高产菌株的发酵法生产番茄红素将是今后的研究热点.%In particular,progress on the preparation methods and research status of lycopone at home and abroad in recent years wereintroduced.Finally,development direction of preparation of lycopene was pointed out that using high-yield strains to produce lycopene will be the most promising way in future.【期刊名称】《应用化工》【年(卷),期】2013(042)008【总页数】4页(P1513-1516)【关键词】番茄红素;理化性质;生产方法【作者】王华;朱中艳;陶美玲;沈敏;乔慧;王璐;胡仁和【作者单位】南京理工大学泰州科技学院化工学院,江苏泰州225300;南京理工大学泰州科技学院化工学院,江苏泰州225300;南京理工大学泰州科技学院化工学院,江苏泰州225300;南京理工大学泰州科技学院化工学院,江苏泰州225300;南京理工大学泰州科技学院化工学院,江苏泰州225300;南京理工大学泰州科技学院化工学院,江苏泰州225300;南京理工大学泰州科技学院化工学院,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】TQ464.2;TS202.3番茄红素是一种天然色素，在自然界分布很广，主要存在于成熟的番茄、西瓜、胡萝卜和红色葡萄柚等果实中。
番茄红素为类胡萝卜素中的一种，具有强抗氧化活性，其抗氧化能力是β-胡萝卜素的3.2倍，是维生素E的100倍，是目前发现的最强的抗氧化剂之一。
噬夏孢欧文氏菌crtY基因在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化李丽;吴柘;郭道森;汪靖超;李荣贵【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2007(028)005【摘要】噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)可以累积类胡萝卜素,合成过程涉及的一系列反应都是在相关酶的催化下完成的,其中番茄红素环化酶由基因crtY编码,催化由番茄红素转化为β-胡萝卜素的酶促反应.本研究以噬夏孢欧文氏菌基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增获得crtY基因,测序正确后克隆进表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b-crtY,重组质粒转化E.coli BL21(DE3),构建工程菌,经IPTG诱导后,重组番茄红素环化酶在大肠杆菌中实现了高效表达,通过镍离子树脂亲和层析和Superdex 75凝胶过滤层析,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌番茄红素环化酶,该蛋白体外具有催化番茄红素转化为β-胡萝卜素的活性.【总页数】5页(P203-207)【作者】李丽;吴柘;郭道森;汪靖超;李荣贵【作者单位】青岛大学生物系,山东,青岛,266071;青岛大学生物系,山东,青岛,266071;青岛大学生物系,山东,青岛,266071;青岛大学生物系,山东,青岛,266071;青岛大学生物系,山东,青岛,266071;山东省天然色素重点实验室,山东,青岛,266071【正文语种】中文【中图分类】Q562【相关文献】1.噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 汪靖超;孙东平;杜桂彩;郭道森;李荣贵2.外源基因在噬夏孢欧文氏菌中的表达 [J], 汪靖超;赵驰;王波;杨宏;李荣贵3.噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 汪靖超;姜颖;杜桂彩;郭道森;李荣贵4.种子特异性表达噬夏孢欧文氏菌crtB基因的植物表达载体构建 [J], 刘慧娟;郎君;冯志国;何光源5.欧文氏菌SCB125中2-酮醛糖酸还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 陈芳;陈策实;尹光琳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
内部★启用前贵州省2024年高考综合改革适应性测试生物学注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、准考证号填写在答题卡上。
2．回答选择题时，选出每小题答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。
回答非选择题时，将答案写在答题卡上。
写在本试卷上无效。
3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：本题共16小题，每小题3分，共48分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项符合题目要求。
1. 鸡枞菌是贵州省常见的珍稀菌种。
对鸡枞菌中蛋白质的氨基酸种类进行分析，测得所含的氨基酸有16种（甲硫氨酸只存在于菌盖）。
下列叙述正确的是（）A. 鸡枞菌的蛋白质发生变性可使肽键断裂B. 鸡枞菌含组成人体蛋白质的全部氨基酸C. 鸡枞菌的菌柄与菌盖蛋白质的种类相同D. 鸡枞菌的多肽链的合成场所位于核糖体2. 为探究某植物对镉（Cd2+）的跨膜运输方式，在一定Cd2+浓度的培养液中水培，设置4组实验：对照组（I）、加入Ca2+通道抑制剂（II）、加入ATP水解酶抑制剂（Ⅲ）、加入K+通道抑制剂（IV），培养一段时间后，测定叶组织中的Cd2+含量，结果如图所示。
下列叙述错误的是（）A. 由图中I、Ⅲ可知，细胞吸收Cd2+存在主动运输B. 由图中I、Ⅳ可知，K+通道蛋白不参与吸收Cd2+C. 细胞吸收Cd2+过程中，Cd2+要与Ca2+通道蛋白结合D. 增加I组培养液的Ca2+含量，可能降低Cd2+吸收量3. 用酵母菌做实验材料探究细胞呼吸，将酵母菌（甲）、细胞质基质（乙）及线粒体（丙）分别放入3支试管，向试管中加入等量、相同浓度的葡萄糖溶液，均供氧充足，一段时间后，得到葡萄糖和CO 2的相对含量变化如图所示。
下列叙述错误的是（ ）A. 甲中产生的CO 2其氧元素来自葡萄糖和水B 乙反应结束后可用酸性重铬酸钾溶液检测酒精C. 甲和乙消耗等量的葡萄糖释放的能量相等D. 实验结果表明葡萄糖不能在线粒体中分解4. 植物中一个胚囊母细胞通过分裂分化，得到4种不同生理功能的细胞，协同完成受精作用。
发酵法生产番茄红素摘要番茄红素是由11个共轭双键及2个非共轭碳碳双键构成的高度不饱和直链型烃类化合物，具有预防癌症、防治心血管疾病、缓解骨质疏松症和提高免疫等重要的生理功能。
番茄红素的生产方法主要有提取法、化学合成法和微生物发酵法。
由于番茄红素含量低，提取法无法满足市场需求；化学合成法存在收率低、产物不稳定以及合成成本高等缺点；发酵法被认为是生产番茄红素最有潜力的方法，文中对发酵法生产番茄红素的关键技术环节(如菌种选育、发酵工艺优化和分离纯化)的研究进展进行了阐述。
关键词番茄红素，发酵工程，菌种选育，发酵工艺优化，分离纯化番茄红素是存在于自然界中的一种天然色素,呈红色, 因最早发现于番茄中得名。
番茄红素(Lycopene)是类胡萝卜素(Carotenoid) 的一种。
主要存在于植物细胞的有色体中,其中番茄中含量最高,达3-14mg/100g，是由l1个共轭双键及2个非共轭碳碳双键构成的高度不饱和直链型烃类化合物，分子式C40H56，分子量536.85。
番茄红素结晶为暗赤色针状或柱状晶，熔点175℃，易溶于氯仿、苯，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮，难溶于甲醇、乙醇，不溶于水。
性质十分活泼，易受氧、紫外线、温度的影响而迅速氧化。
在酸性环境和有CO2存在的条件下以及温度低于50℃的酸性条件下,色素性能稳定。
在自然界中番茄红素主要存在于番茄、西瓜等蔬菜水果中。
1903年Schundc发现番茄中提取的番茄红素的吸收光谱不同与胡萝卜素，将其命名为Lyco-pene。
番茄红素是类胡萝卜素生物合成途径中的一个中间代谢产物。
美国学者最近发现秋橄榄浆果所含的番茄红素相当于番茄的1.8倍。
番茄红素与其他类胡萝卜素一样,动物自身不能合成。
由于番茄红素没有类似胡萝卜素那样的芷香环而没有VA活性,在过去一直不被重视。
然而,近年研究发现其具有优越的生理功能:在类胡萝卜素中,其抗氧化作用最强。
其对单线态氧的淬灭作用是β-胡萝卜素的2倍,维生素E的100倍。
番茄组织培养及其农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LvcB的
遗传转化
任永霞;王罡;郭郁频;王萍;季静
【期刊名称】《北方园艺》
【年(卷),期】2006(000)001
【摘要】LycB(番茄红素β-环化酶)基因是类胡萝卜素生物合成过要分枝点上,直接影响β胡萝卜素的合成.通过农杆菌介导法,利用LycB基因转化重要果菜两用作物--番茄.经PCR及PCR-Southem分子检测证明,目的基因LycB已整合进番茄基因组中.
【总页数】3页(P98-100)
【作者】任永霞;王罡;郭郁频;王萍;季静
【作者单位】天津大学农业与生物工程学院,300072;河北北方学院,张家口,075131;天津大学农业与生物工程学院,300072;河北北方学院,张家口,075131;淮海工学院海洋学院,连云港,222005;天津大学农业与生物工程学院,300072
【正文语种】中文
【中图分类】S6
【相关文献】
1.农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化菊花的研究 [J], 任永霞;季静;王萍;王罡
2.根癌农杆菌介导fw2．2和PL基因对Micro-Tom番茄的遗传转化研究 [J], 孙
瑶;田嘉;林静;李疆
3.八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体的构建及对人参的遗传转化 [J], 何秀霞;张勇;于源华
4.八氢番茄红素合成酶基因(PSY)对大豆的遗传转化 [J], 龚学臣;季静;抗艳红;王罡;吴颖;王萍
5.影响农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化番茄主要因子的研究 [J], 任永霞;王罡;季静;王萍
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园艺学报 2010，37（3）：390–396Acta Horticulturae Sinica超表达草生欧文氏菌crtB基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究张建成，周文静，邓秀新*（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070）摘 要：利用重组PCR技术，将草生欧文细菌八氢番茄红素合成酶基因crtB与豌豆质体定位序列ts-rbc S融合，插入质粒载体PMV中，构建了植物表达载体pBI-ts-rbc S-crtB，并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄。
PCR检测、Southern杂交和RT-PCR分析表明，外源基因crtB已整合到番茄基因组中，并在转基因植株中得到表达。
转基因番茄果实中的类胡萝卜素总量增加1.3 ~ 2.5倍，八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素分别增加了4.3、1.8、2.2和2.3倍。
转化株系中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。
crtB基因过量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。
关键词：番茄；草生欧文氏菌；八氢番茄红素合成酶；载体构建；遗传转化中图分类号：S 641.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）03-0390-07 Overexpression of crtB Gene from Erwinia herbicola Improved CarotenoidsSynthesis in Transgenic TomatoZHANG Jian-cheng，ZHOU Wen-jing，and DENG Xiu-xin*（National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Huazhong Agriculture Univercity，Wuhan 430070，China）Abstract：The fused pea ts-rbc S fragment and crtB gene from Erwinia herbicola was inserted into the PMV plasmid vector, resulting the plant expression vector pBI-ts-rbc S-crtB，which was transformed into tomato by Agrobacterium-mediated transformation. The result of PCR，Southern blot and RT-PCR revealed that foreign crtB gene was integrated and expressed in the transgenic tomato lines. Total carotenoids contents in the fruits of transgenic lines were 1.3–2.5 times higher than that of the control, the phytoene, lycopene，β-carotene and α-carotene contents were 4.3，1.8，2.2，and 2.3 times higer respectively. In addition，the expression of endogenous genes involved in carotenoid synthesis was affected in the transgenic lines. These results suggested that overexpression of crtB significantly enhanced the carotenoids biosynthesis and accumulation in transgenic tomato fruits.Key words：tomato；Erwinia herbicola；phytoene synthease；construction of expression vector；genetic transformation类胡萝卜素具有广泛的生物功能（Bartley & Scolnik，1995；Tracewell et al.，2001；Fraser & Bramley，2004）。
通过对参与类胡萝卜素生物合成基因的遗传操作可改良植物品质（Shewmaker et al., 1999；Ye et al.，2000；Botella-Pavia & Roariguez-Concepidn，2006；Giuliano et al.，2008）。
收稿日期：2009–09–14；修回日期：2010–02–12基金项目：国家自然科学基金项目（30830078；30771482）﹡通信作者Author for correspondence（E-mail：xxdeng@）3期张建成等：超表达草生欧文氏菌crtB基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 391八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase，PSY）催化两个GGPP分子聚合成具40个碳原子的八氢番茄红素，是植物类胡萝卜素生物合成途径中的一个限速酶，其编码基因已成为植物类胡萝卜素基因工程的首选目的基因（朱长甫等，2004）。
在转基因番茄中，番茄PSY的cDNA组成型过量表达，使转化植株类胡萝卜素合成增强，在种皮、子叶和胚轴等部位积累了较多的类胡萝卜素（Fray et al.，1995）。
植物PSY和细菌的八氢番茄红素合成酶（CrtB）均含有一个异戊二烯转移酶结构域，参与GGPP 合成八氢番茄红素的过程。
此外，细菌的CrtB和植物PSY的氨基酸序列仅有30%的同源性，可减少在转基因植物中经常出现的共抑制现象。
因此，细菌crtB基因在植物类胡萝卜素基因工程中被广泛应用。
将番茄PSY1基因的有色体转运肽序列ts-PSY-1与噬夏孢欧文细菌（Erwinia uredovora）crtB基因融合，在番茄果实特异性启动子驱动下导入番茄，转基因番茄植株中的类胡萝卜素含量较野生型番茄增加2 ~ 4倍（Fraser et al.，2002）。
同样，将噬夏孢欧文细菌（Erwinia uredovora）crtB基因导入油菜种子、马铃薯块茎和亚麻种子中特异性过量表达，转基因株系中的类胡萝卜素含量均显著增加（Shewmaker et al.，1999；Ducreux et al.，2005；Fujisawa et al.，2008）。
本试验中将豌豆转运肽ts-rbc S与草生欧文氏菌（Erwinia herbicola）八氢番茄红素合成酶基因crtB 融合，构建了crtB基因的植物表达载体，并通过根瘤农杆菌介导转化番茄，以期增加番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累，为进一步改善植物类胡萝卜素含量等相关研究奠定基础。
1 材料与方法1.1材料与质粒本试验于2006—2007年在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室进行。
番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）‘中蔬5号’种子购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所；质粒PSL525（携带crtB基因）由台湾长庚大学Shih-Tung Liu教授馈赠；豌豆转运肽ts-rbc S的cDNA由本实验室克隆并保存在pMD18-T载体质粒中；植物表达载体质粒PMV由pBI121改良（即将GUS片段缺失，引入含有5′-XbaⅠ-XhoⅠ-SalⅠ-Bam HⅠ-SacⅠ-3′多克隆酶切位点的片段）。
1.2crtB基因植物表达载体的构建根据豌豆ts-rbc S转运肽序列（X00806），草生欧文细菌crtB基因序列（M90698）和PMV载体质粒上酶切位点，分别设计引物ts-rbc S-L：5′-CCGCTCGAGATGGCTTCTATGATATCCTC-3′（含XhoⅠ酶切位点）和ts-rbc S-R：5′-AACAGCCATGCACTTTACTCTTCCAC-3′；crtB-L：5′-GTAAAGTGCATG GCTGTTGGCTCGAA-3′和crt B-R：5′-CGCGGATCCCTAAATCGGGCGCTGCCAGAG-3′（含Bam HⅠ酶切位点），通过PCR技术构建融合基因ts-rbc S-crtB。
重组PCR产物经电泳检测回收，然后用XhoⅠ和Bam HⅠ酶切，回收酶切片段与经同样酶切的PMV质粒载体连接，构建植物表达载体pBI-ts-rbc S-crtB。
PCR、酶切和测序鉴定后，电击法导入根瘤农杆菌EHA105中。
1.3番茄的转化、PCR和Southern杂交、RT-PCR分析番茄转化和再生参考叶志彪等（1994）的方法进行。
番茄叶组织DNA提取采用CTAB法（王关林和方宏筠，2003），以提取的番茄DNA为模板，相应的3对特异性引物（P-L1：5′-GACGAGGCAGCGC GGCT A T-3′和P-R1：5′-AAGAAGGCGA T AGAAGGCGA-3′；P-L2：5′-A TGGCTTCT A TGA T A TCCTC-3′和P-R2：5′-GCACTTT ACTCTTCCAC-3′；P-L3：5′-ATGGCTGTTGGCTCGAA-3′和P-R3：5′-CTAAATCGGGCGC TGCCAGAG-3′）分别对NPTⅡ基因、ts-rbcS序列和crtB基因进行PCR扩增检测，同时设阳性和野生型番茄作为对照。
PCR条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
Southern杂交采用Roche公司的“DIG High Prime DNA392 园 艺 学 报 37卷 Labelling and Detection Starter Kit Ⅱ”地高辛标记试剂盒的方法进行。
此外，提取转基因番茄果实RNA （Liu et al.，2006），利用RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit （MBI 公司）合成cDNA 第一链，RT-PCR 分析转基因植株中crtB 基因的表达。
其中crtB 基因的扩增引物为5′-TACGCGTTTGATCATCTGGA-3′和5′-CCTTCACCCCAATTTTACGA-3′，内参基因Ef-1α的引物为5′-ATGTTGGGTTCAATGTTAAG-3′和5′-ATCACACTGCACAGTTCAC-3′。
