大学课件常用分子生物学技术的原理及应用
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常用分子生物学技术的原理及其应用
产。
基因突变技术的最新进展
近年来，随着技术的发展，基因突变技术不断取得新 的突破和进展。
输标02入题
高通量突变筛选技术使得能够在短时间内对大量基因 进行突变和筛选，加速了基因功能研究和药物研发的 进程。
01
03
基因编辑技术的出现，如CRISPR-Cas9系统，使得能 够实现精准地编辑基因组，为基因治疗和生物育种等
01
02
03
04
基因突变技术在生物工程中广 泛应用于菌种改良、基因治疗
和生物制药等领域。
通过基因突变技术可以改良微 生物菌种的代谢途径，提高产
物的产量和品质。
在基因治疗中，基因突变技术 可用于纠正致病基因的缺陷， 治疗遗传性疾病和癌症等疾病
。
在生物制药中，基因突变技术 可用于产生具有特定性质的蛋 白质或酶，用于药物研发和生
常用分子生物学技术的原理及其应 用
目 录
• 基因克隆技术 • 基因表达技术 • 基因突变技术 • 蛋白质组学技术
01 基因克隆技术
基因克隆技术原理
基因克隆技术是通过将外源DNA片段插入到载体DNA中，然后将其转化到宿主细胞 中进行复制和表达，从而获得目的基因或基因片段的过程。
基因克隆的关键步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、DNA连接、转化 和筛选。
疾病治疗
基因表达技术可用于疾病 治疗，如基因疗法和基因 编辑等。
基因表达技术的最新进展
CRISPR-Cas9系统
这是一种新型的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9蛋白的引导，实现对特 定DNA序列的切割和编辑。
人工染色体
通过基因表达技术，可以人工构建染色体，实现生物体的染色体数目和结构的 改变。
领域带来了革命性的变革。
基因突变技术的最新进展
近年来，随着技术的发展，基因突变技术不断取得新 的突破和进展。
输标02入题
高通量突变筛选技术使得能够在短时间内对大量基因 进行突变和筛选，加速了基因功能研究和药物研发的 进程。
01
03
基因编辑技术的出现，如CRISPR-Cas9系统，使得能 够实现精准地编辑基因组，为基因治疗和生物育种等
01
02
03
04
基因突变技术在生物工程中广 泛应用于菌种改良、基因治疗
和生物制药等领域。
通过基因突变技术可以改良微 生物菌种的代谢途径，提高产
物的产量和品质。
在基因治疗中，基因突变技术 可用于纠正致病基因的缺陷， 治疗遗传性疾病和癌症等疾病
。
在生物制药中，基因突变技术 可用于产生具有特定性质的蛋 白质或酶，用于药物研发和生
常用分子生物学技术的原理及其应 用
目 录
• 基因克隆技术 • 基因表达技术 • 基因突变技术 • 蛋白质组学技术
01 基因克隆技术
基因克隆技术原理
基因克隆技术是通过将外源DNA片段插入到载体DNA中，然后将其转化到宿主细胞 中进行复制和表达，从而获得目的基因或基因片段的过程。
基因克隆的关键步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、DNA连接、转化 和筛选。
疾病治疗
基因表达技术可用于疾病 治疗，如基因疗法和基因 编辑等。
基因表达技术的最新进展
CRISPR-Cas9系统
这是一种新型的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9蛋白的引导，实现对特 定DNA序列的切割和编辑。
人工染色体
通过基因表达技术，可以人工构建染色体，实现生物体的染色体数目和结构的 改变。
领域带来了革命性的变革。
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
分子生物学PPT课件
04 蛋白质的结构与功能
蛋白质的化学组成与结构
蛋白质的基本组成单 位
氨基酸，具有氨基和羧
基的有机化合物。
氨基酸的种类
20种常见氨基酸，根据 侧链R基的不同进行分 类。
蛋白质的一级结构
氨基酸的线性排列顺序 ，包括肽键和二硫键的 连接。
蛋白质的高级结构
二级结构（α-螺旋、β折叠等）、三级结构和 四级结构。
01
其他RNA
如miRNA、snRNA等，在基因表达调控、 RNA加工等方面发挥作用。
04
03
RNA的合成与加工
01
02
03
转录
以DNA为模板，通过RNA 聚合酶的作用，合成RNA 的过程。
加工
新合成的RNA需要经过一 系列加工过程，如剪接、 修饰等，才能成为成熟的 RNA分子。
转录后调控
通过RNA干扰、RNA编辑 等方式对RNA进行转录后 水平的调控，影响基因的 表达。
03
DNA连接酶的种类和应用
04
重组DNA分子的构建和筛选
PCR技术及其应用
01
PCR技术的原理及步骤
02
03
04
引物的设计与优化
PCR反应体系的组成及优化
PCR技术的应用举例
基因克隆与基因工程
基因克隆的定义和原理 基因表达载体的构建和选择
基因工程的基本步骤 基因工程的应用举例
分子生物学在医学、农业等领域的应用
医学领域的应用
基因诊断、基因治疗、药物研 发等
工业领域的应用
酶工程、发酵工程、生物制药 等
农业领域的应用
转基因作物、基因编辑育种、 农业生物技术等
环境领域的应用
环境监测、污染治理、生态修 复等
分子生物学技术及其应用(共36张PPT)
3’
ATGCGGTACCAT
5’ 测序模板
5’
TA
5’
TACGCCA
第一套反应
5’
TACGCCATGGTA
TA C TACGC
第二套反应
TACGCC
TACG TACGCCATG
第三套反应
TACGCCATGG
T TACGCCAT TACGCCATGGT
第四套反应
A CGT
A
TACGCCATGGTA
T
②促进 突变基因对Bip基因表达的促进作用降低，进而影响了感光细胞中
的蛋白质折叠
11.（1）mRNA 核糖体 （见右图）
干扰人类其他基因的表达
（2）CO2（1分） 选择透过（1分） 种的肠癌细胞没有排斥反应
无胸腺，失去特异性免疫，对接
（3）反义脱氧核苷酸链 瘤体重量 （更加）接近100%
1. 5对 1、2、4
2.AD
3.⑴正常启动子P左侧序列未知 BglII和DNA连接
MscI C和B
⑷卡那霉素
X-Gluc 正常启动子P驱动gus基因仅在幼根及根毛中
特异性表达，而缺失体中gus基因在根、叶和花粉均表达
M、Q
4.（1）1、2、3 第3和第2枝段的PbmRNA 依次出现
由第1枝段依次向2、3枝段运输
（2）逆转录 mRNA
TACGCCATGGT
G TACGCCATGG
G
TACGCCATG
T
TACGCCAT
A
TACGCCA
C TACGCC
C TACGC G TACG
C TAC A TA TT
2.自动化测序 双脱氧链终止法荧光标记原理
ddATP-绿色荧光 ddTTP-红色荧光 ddCTP-蓝色荧光 ddGTP-橙色荧光
分子生物学常用技术原理课件
PCR技术及其应用
学习聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作步骤，并了解其在基因分型、基因表 达研究中的应用。
DNA电泳技术
探索DNA电泳分析的技术原理，学会分析DNA片段大小和浓度。
溶胶凝胶电泳技术
了解溶胶凝胶电泳的工作原理，掌握对RNA和蛋白质的分析方法。
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
学会使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析DNA和蛋白质，探索其在分子生物学研究中的应用。
同源重组技术
研究同源重组技术的原理和应用，了解如何将外源DNA导入细胞以实现基因修饰。
转化技术
学习转化技术的原理和方法，掌握将外源DNA导用技术原理 课件
通过本课件，我们将深入探讨分子生物学中常用的实验技术原理，从DNA提 取到细胞培养，帮助您理解这个引人入胜的科学领域。
基本分子生物学实验技术概述
了解分子生物学实验的基本原理和常见技术，包括PCR、DNA电泳等。
DNA提取和纯化技术
掌握从不同样本中提取和纯化DNA的方法，了解其在遗传学和疾病研究中的应用。
分子生物学常用技术共35张-2024鲜版
•分子生物学概述•基因克隆技术•核酸测序技术•蛋白质组学技术•基因表达调控研究技术•细胞信号传导途径研究技术•生物信息学在分子生物学中应用contents目录01分子生物学概述分子生物学定义与发展分子生物学定义发展历程包括基因的结构、功能、表达调控以及基因组的结构、功能与进化等。
基因与基因组研究DNA 复制、转录与翻译蛋白质组学基因表达调控研究DNA 的复制、转录和翻译过程及其调控机制，揭示遗传信息在细胞内的传递和表达规律。
研究细胞内所有蛋白质的表达、功能及其相互作用，揭示蛋白质在生命活动中的作用机制和调控规律。
研究基因表达的时空特异性及其调控机制，包括转录因子、表观遗传学修饰等。
分子生物学研究内容分子生物学与生物技术关系生物技术定义生物技术是以生命科学为基础，利用生物（或生物组织、细胞及其他组成部分）的特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，以及与工程原理和技术相结合进行社会生产或为社会服务的一种综合性技术。
分子生物学对生物技术的影响分子生物学的发展为生物技术提供了重要的理论基础和技术支持，推动了基因工程、细胞工程、发酵工程等生物技术的飞速发展。
同时，生物技术的发展也反过来促进了分子生物学的深入研究，为揭示生命现象的本质和规律提供了有力手段。
02基因克隆技术步骤目的基因的获取载体的选择与构建030201重组DNA分子的构建将目的基因与载体连接，形成重组DNA分子。
重组DNA分子的转化将重组DNA分子导入受体细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等。
转化细胞的筛选与鉴定通过选择性培养基或PCR等方法筛选含有重组DNA分子的细胞，并进行鉴定。
0102载体选择构建策略添加启动子和终止子添加选择性标记优化载体结构030405载体选择与构建策略重组DNA转化与筛选方法转化方法筛选方法03核酸测序技术1. DNA模板制备2. 引物设计3. 测序反应4. 产物纯化015. 变性凝胶电泳026. 放射自显影031 2 3NGS技术原理NGS技术特点NGS技术应用第二代测序技术（NGS）简介第三代测序技术（TGS）展望TGS技术原理TGS技术特点TGS 技术应用前景04蛋白质组学技术蛋白质组学概念及研究内容蛋白质组学概念研究内容层析法利用不同物质在固定相和流动相之间分配系数的差异进行分离，如凝胶层析、离子交换层析等。
《分子生物学技术》课件
基因克隆和序列分析
获取目标蛋白质的基因序列， 进行必要的克隆操作和序列分 析。
表达和纯化
将改造后的基因导入表达系统 ，表达并纯化目标蛋白质。
确定目标蛋白质
根据实际需求，选择需要改造 的蛋白质。
基因突变和改造
根据需要，对基因进行突变和 改造，以改变蛋白质的结构和 功能。
性能评估
对改造后的蛋白质进行性能评 估，包括结构和功能分析。
CHAPTER 03
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术的定义与原理
蛋白质工程技术的定义
蛋白质工程技术是通过基因工程技术 对蛋白质进行改造，以达到改善或优 化蛋白质的特性和功能的一种技术手 段。
蛋白质工程技术的原理
基于基因工程技术，通过改变蛋白质 编码基因的序列，实现蛋白质结构和 功能的优化。
蛋白质工程技术的操作步骤
《分子生物学技术》 ppt课件
contents
目录
• 分子生物学技术概述 • 基因工程技术 • 蛋白质工程技术 • 基因组学技术 • 生物信息学技术
CHAPTER 01
分子生物学技术概述
定义与分类
定义
分子生物学技术是以分子为研究 基础，通过分析分子的结构、功 能和相互作用的科学方法。
分类
分子生物学技术包括基因工程技 术、蛋白质工程技术、基因组学 技术和生物信息学技术等。
详细描述：基因工程技术是一种利用重组DNA技术对生物体的遗传物质进行操作 的方法。其原理基于分子遗传学和生物化学的基本原理，通过人工设计和构建基 因表达载体，将外源基因导入受体细胞，实现基因的转移、表达和调控。
基因工程技术的操作步骤
总结词：全面解析
详细描述：基因工程技术主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检 测等步骤。其中，基因表达载体的构建是整个技术的核心环节，涉及到限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶的应用。
获取目标蛋白质的基因序列， 进行必要的克隆操作和序列分 析。
表达和纯化
将改造后的基因导入表达系统 ，表达并纯化目标蛋白质。
确定目标蛋白质
根据实际需求，选择需要改造 的蛋白质。
基因突变和改造
根据需要，对基因进行突变和 改造，以改变蛋白质的结构和 功能。
性能评估
对改造后的蛋白质进行性能评 估，包括结构和功能分析。
CHAPTER 03
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术的定义与原理
蛋白质工程技术的定义
蛋白质工程技术是通过基因工程技术 对蛋白质进行改造，以达到改善或优 化蛋白质的特性和功能的一种技术手 段。
蛋白质工程技术的原理
基于基因工程技术，通过改变蛋白质 编码基因的序列，实现蛋白质结构和 功能的优化。
蛋白质工程技术的操作步骤
《分子生物学技术》 ppt课件
contents
目录
• 分子生物学技术概述 • 基因工程技术 • 蛋白质工程技术 • 基因组学技术 • 生物信息学技术
CHAPTER 01
分子生物学技术概述
定义与分类
定义
分子生物学技术是以分子为研究 基础，通过分析分子的结构、功 能和相互作用的科学方法。
分类
分子生物学技术包括基因工程技 术、蛋白质工程技术、基因组学 技术和生物信息学技术等。
详细描述：基因工程技术是一种利用重组DNA技术对生物体的遗传物质进行操作 的方法。其原理基于分子遗传学和生物化学的基本原理，通过人工设计和构建基 因表达载体，将外源基因导入受体细胞，实现基因的转移、表达和调控。
基因工程技术的操作步骤
总结词：全面解析
详细描述：基因工程技术主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检 测等步骤。其中，基因表达载体的构建是整个技术的核心环节，涉及到限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶的应用。
分子生物学课件(共51张PPT)(2024)
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
21
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
抗体：参与免疫应答。
2024/1/29
功能蛋白
激素：调节生物体的生理活动。
蛋白质的分类还可以根据其溶解度、形状等进行划分。 例如，根据溶解度可分为清蛋白、球蛋白等；根据形状 可分为纤维状蛋白和球状蛋白等。
RNA的基本组成单位是核糖核苷酸， 由磷酸、核糖和碱基组成。
磷酸二酯键
核糖核苷酸之间通过磷酸二酯键连接 形成RNA链。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌呤（A）、 鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶 （U）。
2024/1/29
12
RNA的种类与结构
mRNA
信使RNA，负责携带遗 传信息并指导蛋白质合
成。
翻译水平调控
通过控制翻译的起始、延伸和 终止来调控基因表达。
蛋白质水平调控
通过控制蛋白质的活性、稳定 性和相互作用来调控基因表达
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
2024/1/29
18
05
蛋白质的结构与功能
2024/1/29
19
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
2024/1/29
tRNA
转运RNA，负责携带氨 基酸并识别mRNA上的
遗传密码。
rRNA
其他RNA
核糖体RNA，是核糖体 的组成部分，参与蛋白
质合成。
13
如miRNA、snRNA等， 在基因表达调控等方面
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
21
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
抗体：参与免疫应答。
2024/1/29
功能蛋白
激素：调节生物体的生理活动。
蛋白质的分类还可以根据其溶解度、形状等进行划分。 例如，根据溶解度可分为清蛋白、球蛋白等；根据形状 可分为纤维状蛋白和球状蛋白等。
RNA的基本组成单位是核糖核苷酸， 由磷酸、核糖和碱基组成。
磷酸二酯键
核糖核苷酸之间通过磷酸二酯键连接 形成RNA链。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌呤（A）、 鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶 （U）。
2024/1/29
12
RNA的种类与结构
mRNA
信使RNA，负责携带遗 传信息并指导蛋白质合
成。
翻译水平调控
通过控制翻译的起始、延伸和 终止来调控基因表达。
蛋白质水平调控
通过控制蛋白质的活性、稳定 性和相互作用来调控基因表达
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
2024/1/29
18
05
蛋白质的结构与功能
2024/1/29
19
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
2024/1/29
tRNA
转运RNA，负责携带氨 基酸并识别mRNA上的
遗传密码。
rRNA
其他RNA
核糖体RNA，是核糖体 的组成部分，参与蛋白
质合成。
13
如miRNA、snRNA等， 在基因表达调控等方面
常用分子生物学技术的原理及应用
根据中心法则，可以RNA为模板，在逆转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 根据mRNA的3’端有poly(A)的特点，在进行反转录时，就以poly(A)为模板设计了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据poly(A)的原理设计的。 根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。
由宿主控制的限制与修饰作用使得细菌避免噬菌体感染，如果噬菌体DNA没有被修饰过，进入宿主就会被限制性酶切断。如果被修饰过，其侵染细菌的效率就提高。
限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用
分子克隆 (Molecular Cloning)
1.Vectors
Vectors: A DNA (a plasmid or a phage DNA) that serves as a carrier in gene cloning experiments.
本章常用技术词汇
一 基因工程与分子克隆
(genetic engineering and molecular cloning)
Research content: genomic library, cDNA library, gene cloning, gene expression, gene regulation, gene knockout 用于基因克隆的工具酶 (enzymes for gene cloning) 在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。
以DNA一条链为模板， 诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在转录起始位点 以ATP、GTP、CTP和UTP为前体，合成(转录)RNA 当遇到转录终止信号时，转录即停止。
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玻璃板 Whatman滤纸 NC膜或尼龙膜 凝胶 Whatman滤纸
12
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
Southert blotting用途
• 基因组DNA的定性与定量分析。
如对在基因组中特异基因的定位及检测等。
•重组质粒和噬菌体的分析。
放射 自显 影照 片
（二）RNA印迹技术(Northern blotting)
2. 印迹(blotting)定义
将存在于凝胶中的生物大分子转移（印 迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分 析的技术。
3. 应用 广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测
4. 发展 电转移印迹技术、
真空吸引转移印迹等
（二）探针技术
探针(probe)的概念
是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素或 荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能够 与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测核 酸样品中是否存在某一特定的基因。
常用分子生物学技术 的原理及应用
The popular technology in molecular biology: principle and application
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular hybridization & blotting technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
原始文献出处
Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸） and hybridization with DNA probes.
的表达水平。 • 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
Northern blotting 结果
由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟 以上两种技术应用的越来越少
（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹)
与DNA和RNA印迹相似之处
首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小 分开，再将蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上， 蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。
J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.
（一）印迹技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
琼脂糖分离的DNA片段 → 变性为单链 → 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 → 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到 NC膜上，使之成为固相化分子。
载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与 另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有 互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的 DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的 区带。
探针的种类
寡核苷酸探针 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针
探针技术的概念
将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进 行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序 列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放 射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有 同源的核酸分子存在。
二、印迹技术的类别及应用
• 检测样品中的特异蛋白质的存在。 • 细胞中特异蛋白质的定量分析。 • 蛋白质分子的相互作用研究。
辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中 含有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接 （标记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，
与DNA和RNA印迹不同之处
• 蛋白质的转移只有靠电转移。 • 蛋白质的检测以抗体作探针。 • 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检
测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 • 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。
Western blotting应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
（一）Southern blotting 1 2 M
内切酶
基因组DNA
重物 纸巾 转移缓冲液
500g
支持物
DNA酶切片段
三
种
印
迹
技
术
的
比
较
水平槽
水平槽
垂直槽
Southern blotting Northern blotting Western blotting
其他印迹技术
• 斑点印迹 (dot blotting) • 原位杂交 (in situ hybridization) • DNA芯片技术 (DNA chip)
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中，把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形 成杂化双链的这种现象。
杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程
Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354
名称相对于Southern blotting
相同点： 原理均为毛细作用。 不同点
•转移的是RNA •转移前无需酶切 •转移效率较高 •变性方法
（二）RNA印迹技术
Northern blotting 用途 • 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA
并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
Western blotting应用
用已知的特异 抗体检测目的 基因蛋白
重组人酪蛋白激酶2α
SDS-PAGE purified recombinant human CK2α(重组人酪蛋白
激酶2α) subunit and its Western blotting
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
原始文献出处：
Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
12
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
Southert blotting用途
• 基因组DNA的定性与定量分析。
如对在基因组中特异基因的定位及检测等。
•重组质粒和噬菌体的分析。
放射 自显 影照 片
（二）RNA印迹技术(Northern blotting)
2. 印迹(blotting)定义
将存在于凝胶中的生物大分子转移（印 迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分 析的技术。
3. 应用 广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测
4. 发展 电转移印迹技术、
真空吸引转移印迹等
（二）探针技术
探针(probe)的概念
是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素或 荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能够 与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测核 酸样品中是否存在某一特定的基因。
常用分子生物学技术 的原理及应用
The popular technology in molecular biology: principle and application
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular hybridization & blotting technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
原始文献出处
Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸） and hybridization with DNA probes.
的表达水平。 • 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
Northern blotting 结果
由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟 以上两种技术应用的越来越少
（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹)
与DNA和RNA印迹相似之处
首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小 分开，再将蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上， 蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。
J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.
（一）印迹技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
琼脂糖分离的DNA片段 → 变性为单链 → 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 → 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到 NC膜上，使之成为固相化分子。
载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与 另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有 互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的 DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的 区带。
探针的种类
寡核苷酸探针 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针
探针技术的概念
将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进 行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序 列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放 射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有 同源的核酸分子存在。
二、印迹技术的类别及应用
• 检测样品中的特异蛋白质的存在。 • 细胞中特异蛋白质的定量分析。 • 蛋白质分子的相互作用研究。
辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中 含有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接 （标记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，
与DNA和RNA印迹不同之处
• 蛋白质的转移只有靠电转移。 • 蛋白质的检测以抗体作探针。 • 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检
测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 • 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。
Western blotting应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
（一）Southern blotting 1 2 M
内切酶
基因组DNA
重物 纸巾 转移缓冲液
500g
支持物
DNA酶切片段
三
种
印
迹
技
术
的
比
较
水平槽
水平槽
垂直槽
Southern blotting Northern blotting Western blotting
其他印迹技术
• 斑点印迹 (dot blotting) • 原位杂交 (in situ hybridization) • DNA芯片技术 (DNA chip)
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中，把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形 成杂化双链的这种现象。
杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程
Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354
名称相对于Southern blotting
相同点： 原理均为毛细作用。 不同点
•转移的是RNA •转移前无需酶切 •转移效率较高 •变性方法
（二）RNA印迹技术
Northern blotting 用途 • 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA
并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
Western blotting应用
用已知的特异 抗体检测目的 基因蛋白
重组人酪蛋白激酶2α
SDS-PAGE purified recombinant human CK2α(重组人酪蛋白
激酶2α) subunit and its Western blotting
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
原始文献出处：
Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.