第十五章重组干扰素生产工艺

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ挑取单菌落于液体ypdzeocin100mgml培养基中300rmin30培养至od600为15取1ml稀释至100ml同样培养基中振荡培养至od6007000rmin4离心15分钟取上清液经硫胺盐析浓缩透析用无菌水5ml溶解后以125的分离胶做sdspage分析
重组干扰素-α
演讲：谢思思 PPT制作：朱宇婷、张芳芳 资料查找：陈雪梅、方琦璐、钱媛 媛、夏烽、董敏健、袁海剑
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IFNα-2b简介
IFNα-2b是苏黎世大学Charles Weissmann实验室最新发现的抗病毒 药物，由Biogen公司发展的，最终由Schering-Plough公司出品，商品名 为Intron-A。它应用于多种适应症，包括病毒性感染和肿瘤。它被批准用 于乙、丙型肝炎、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、良性 肿瘤和恶性黑色素瘤的治疗等的治疗。
干扰素（IFN)简介
• 干扰素是由多种细胞产生的一组蛋白质类细胞因子，具有广泛的 抗病毒，抗肿瘤免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据其来源、分子结构和抗原性的差异分为α,β,γ,ω四个类型。α 型干扰素又依其结构的不同再分为α-1b, α-2a, α-2b等亚型，其具 体表现在个别氨基酸的差异上。我们要具体讲讲rhIFN α-2b的生产 工艺设计。
来源于维基百科 理化性质：
分子量：19247 结构特点：四个Cys残基，形成两个二硫键
无糖基化位点 PI:5-6 在的溶液中稳定，对热也稳定 对各种蛋白酶敏感，比活为2X10^8 IU/mg
制备工艺路线：
制备工艺过程
• 基因的制备 • 构建重组质粒 • 酵母转化 • 发酵及表达产物的SDS-PAGE分析 • 样品的纯化

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❖５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的 1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以 12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。 ６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。 ７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L 乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温 放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的 质粒ＤＮＡ。 ８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 ９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后 可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE （pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260 ＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。
从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
→工程菌
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一、目的基因的分离与获得
❖ 1. 设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内 或5‘-端最好有内切酶酶切位点。
❖ 2. 有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。 ❖ 3. 破碎细胞，提取细胞总mRNA. ❖ 4. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基
❖ 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐 中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速， 控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液

提取重组质 粒④
7)用合适转头于室温以5000转/分离心15分钟，回收核酸。如于4 ℃离心， 盐也会生成了沉淀。 8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇 洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所 有液滴，于室温将瓶倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 9)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀. 10)纯化。
质粒DNA的纯
化①
（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1)将核酸溶液所得转入15mlCorex管中，再加3ml用冰预冷的5mo1/L LiCl溶液， 充 分混匀，用合适转头于4 ℃下以10000转/分离心I0分钟。LiCI可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34 转头(或与其相当的转尖)于室温以10000转/分离心10分钟，回收沉淀的核酸。
白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标 作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。
(6)残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于
100pg. (7)残余血清lgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法吋必须进行此项检定。
重组体引入宿主 细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体 DNA 分子在 一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。
从大肠杆菌K12获取目 的基因
由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与 目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突 变情况

干扰素的生产工艺过程1．菌种制备取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。

然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。

2．种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。

3．发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。

级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。

然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。

同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。

或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。

4．菌体收集将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。

进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。

菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。

每保存3个月，检查一次活性。

11.4.3.4 干扰素发酵过程控制在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。

而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。

可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程控制。

1．溶解氧控制分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。

通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。

2．温度控制假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。

产物合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解，而其最佳生长温度则为30℃。