大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵
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重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达
重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达卢晨;赵辉;邹文艺;范清林;付永标;宋礼华【摘要】Because of original human interferon α-2b ( huIFNα-2b) gene sequence in prokaryotic expression system always with low level of target protein, the code of huIFNα-2b gene was mutagenize according to usage in prokaryotic organism without changing the amino acid compsition. The mutated gene of huIFNα-2b was fused to the secretion signal coding sequence of Escherichia coli heat-stable enterotoxin Ⅱ ( ST Ⅱ ) . Primers was designed for introducing fitting restriction sites to the fusion gene, then cloned into vectors pCSE,pET-22b and pPAK4L. They have constitutive expression promoter, T7 promoter and phoA promoter individually. With fusion gene,pCSE expressed huIFNα-2b protein in low yield in different hosts , nearly 50％ of the protein can be secreted. Induced by IPTG, pET-22b gets high level expression of huIFNα-2b in E. coli BL21 , but the ST Ⅱ signal can not be cutted efficiently. In low-phosphate growth media. E. coli W3110 with vector pPAK4L which contains the target gene synthesized approximately 20μg huIFNα-2b/ml A550 unit of cells , and about 30％ of it can be secreted into periplasimic space.%人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变.将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIF Nα-2b基因融合并于信号肽5'端和huIFNα-2b基因3'端引入合适的酶切位点.融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子.融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌.在E.coli BL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除.含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coli W3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μ/g/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)003【总页数】5页(P58-62)【关键词】人干扰素α-2b;STⅡ信号肽;分泌;大肠杆菌 W3110【作者】卢晨;赵辉;邹文艺;范清林;付永标;宋礼华【作者单位】安徽大学生命科学学院,合肥,230039;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽大学生命科学学院,合肥,230039;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088【正文语种】中文【中图分类】Q789人干扰素α-2b(huIFNα-2b)成熟蛋白是一种由164个氨基酸构成的多肽,在一定诱导因素的作用下由人体白细胞产生,具有抗病毒、抗肿瘤、影响细胞生长分化和调节机体免疫功能等活性[1],是发现最早、研究最多、第一个克隆化生产并应用于临床治疗的细胞因子。
重组人干扰素α-2b工程菌的培养与发酵条件的优化研究
重组人干扰素α-2b工程菌的培养与发酵条件的优化研究姚文兵;许敏;吴梧桐;沈子龙
【期刊名称】《中国药科大学学报》
【年(卷),期】2000(31)6
【摘要】用均匀设计法对重组人干扰素α-2b基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化，确定摇瓶培养基组成为：每升含蛋白胨10 g、葡萄糖6 g、酵母粉5 g、Na2HPO4 6 g、KH2PO4 2 g、NH4Cl 0.8 g、NaCl 4 g、CaCl2 0.01 g、MgSO4 0.2 g，发酵表达条件为：pH 6.9，温度37℃，IPTG诱导后表达时间为5 h左右，装料量为20%。
三批小试结果为：湿菌体平均产率18 g/L，生物活性3.93×108IU/L。
发酵罐三批中试放大试验，湿菌体平均产率为29 g/L，生物活性为6.68×108IU/L发酵液。
【总页数】4页(P462-465)
【关键词】重组人干扰素α-2b;基因表达;发酵条件;Q784
【作者】姚文兵;许敏;吴梧桐;沈子龙
【作者单位】中国药科大学生物制药学院生物技术中心
【正文语种】中文
【中图分类】Q784
【相关文献】
1.重组人干扰素α2b大批量发酵条件的研究 [J], 尹凤红
2.重组人α-2b干扰素发酵及粗提条件的优化研究 [J], 周园;陈维多;王大勇;苏云明
3.重组人干扰素α-2b工程菌培养条件的优化研究 [J], 余琼;王超;孙怡宁;邹积宏
4.重组人mα2b干扰素工程菌的发酵与表达 [J], 宋礼华;杨少民
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组人干扰素α-2b
重组人干扰素α-2b生产工艺设计(赵杨杨，河南城建学院，平顶山，4567000)摘要：重组人干扰素α-2b(rIFN 2b)是一种广谱抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能的药物。
干扰素是病毒进入机体后诱导宿主细胞产生的反应物，它从细胞释放后可促使其他细胞抵抗病毒的感染，干扰素增强免疫功能的机理是：调节机体的免疫监视，防御和稳定功能，使杀伤(NK)细胞、Tc细胞的细胞毒杀伤作用增强；使吞噬细胞的活力增强；诱导外周血液中单核细胞活性；增加或诱导细胞表皮主要组织相容复合物抗原的表达。
临床用于治疗多发性骨髓病，后天免疫缺损症(AIDS)病人所患的卡波济肉瘤、恶性黑色素瘤、毛状细胞白血病及慢性活动性乙型肝炎。
关键词：重组人干扰素α-2b、菌种构建、分离、纯化、检测1.基因工程假单胞杆菌菌种的建立1.1干扰素基因的克隆从感染新城疫病毒的人血红白细胞中分离干扰素α-2b基因的mRNA，由逆转录酶将Poly（A）RNA反转录形成cRNA第一链。
再由DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段催化聚合形成cDNA第二条链。
在dCTP存在的条件下，利用末端转移酶给cDNA加Poly（dC)尾，连接到质粒pBR322上。
转化到大肠杆菌感受态细胞中，并用氨苄青霉素和四环素筛选抗性克隆，获得编码人干扰素α-2b的基因序列。
1.2干扰素表达载体的构建把干扰素基因与宿主载体pAYC37连接，筛选出序列正确的表达载体pVG。
将表达载体导入假单胞杆菌中，筛选得到干扰素工程菌，表达重组人干扰素-α-2b不低于2.0×109IU/L，并具有氨苄青霉素、四环素和链霉素的抗性。
2. 重组人干扰素α-2b发酵与纯化2.1重组人干扰素α-2b工程菌的发酵取菌种1ml接种于100ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)的锥型瓶中,摇床30℃震荡培养6~7h,OD值达0.6~0.7h,按1∶20的比例转种于1000ml LB培养基中,摇床30℃震荡培养7~8h,OD值达1.0~1.2h,接种30L发酵罐中,30℃培养4~5h后,42℃培养4h,离心收集菌体。
大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵
大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵作者：丁少云指导老师：江诚(安徽医学高等专科学校，安徽合肥，231000)摘要：目的: 探索获得大肠杆菌的高密度发酵和高效表达分泌型重组人干扰素α-2b 的方法。
方法: 通过小试研究获得大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2b 发酵的基本条件; 通过中试研究碳源、氮源等营养物质补加的方式;同时就单独补充碳源、分别补充碳源和氮源的两种不同的发酵方式进行对比分析。
结果: 经优化后的发酵条件, 最终菌体的光密度可达A 600 = 70, 分泌型重组人干扰素α-2b 终产品为120 g· L - 1菌体, 平均比活性为2.2×108 IU ·m g- 1蛋白。
结论: 获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFN α-2b 的高表达条件。
关键词：重组人干扰素α-2b; 大肠杆菌; 发酵1.引言干扰素α-2b (interferonα-2b, IFNα-2b) 是由165 个氨基酸组成的单链多肽, 理论分子量为19219, 由两对二硫键构成, 有一定空间结构, 其中29-138位的二硫键对于维持活性尤其重要[ 1 ] 。
干扰素是最早通过基因工程技术表达的蛋白质之一。
利用传统的胞内表达方法有一定的缺陷, 如蛋白始终以还原状态存在, 无法形成正确的三级结构。
本课题组利用分泌型表达技术构建的IFNα-2b工程菌,使所表达的外源蛋白直接分泌于细菌的细胞间质中, 有利于蛋白质纯化; 同时, 所表达的蛋白同天然IFNα-2b有相同的一、二、三级结构, 因此有100%的生物学活性。
本实验研究了大肠杆菌重组人IFNα-2b的发酵工艺,对比单独补充碳源、同时补充碳源和氮源的两种不同方式的发酵方法, 获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFNα-2b的高表达条件。
2.材料与方法2.1 菌种工程菌为E .coli JM 101, 基因型F -m crA m crB IN (rrnD -rrnE ) lam da, 来自A T C C ;IFN α-2b cD N A 来自安徽农业大学免疫学教研室; 用于构建表达质粒的起始质粒P S T Ⅱ其结构包括碱性磷酸酶启动子(phoAprom oter)、翻译增强子序列、SD序列、S T Ⅱ信号肽序列、A m p 及T et抗性基因、复制起点。
重组人干扰素凝胶
4保存、运输及有效期
于 0~20X: 避光保存和运输，自生产之日起，按批准 的有效期执行。
5使用说明
应符合"生物制品包装规程"规定和批准的内容。
• 2宜的方法收集、处理菌体。 2.2.5初步纯化 注射用重组人干扰素 2b (酵母） 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达 Zhusheyong Chongzu Ren Ganraosu a2b (Jiaomu) 到规定的要求。 Recombinant Human Interferon a2b 2. 2 . 6 高 度 纯 化 for Injection (Yeast) 经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行髙度纯 化，使其达到 3.1 项要求，即为重组人干扰素《 2b 原液 本品系由高效表达人干扰素 a2b 基因的酿酒酵母，经 发酵、分离和髙度纯化后获得的重组人干扰素 a2b 冻干制 成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素， 加人适宜稳定剂，除菌过滤后于适宜温度下保存，并规定 其有效期。 2.2.7 原液检定 按 3.1 项进行。 2.3半成品 2. 3 . 1 配 制 与 除 菌 2-3.1.1 稀释液配制 按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于 稀释。 2.3.1.2 稀释与除菌 将检定合格加稳定剂的重组人干扰素a2b原液用 2. 3.1.1 项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成
3检定
3.1原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（附录 X C)。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（附录VI B第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含ft之比，每lmg蛋白质应 不低于1.0X10* IU。
重组人干扰素a2b凝胶 3.1.4 纯度 3.1. 4. 1 电 泳 法 依法測定（附录 IVC 〉。用非还原型 SDS "聚丙烯酰胺 凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%,加样量应不低于 lOfig (考马斯亮蓝 R250 染色法）或 5fig (银染法）。经扫 描仪扫描，纯度应不低于95.0% 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（附录 m 为5 B)。色谱柱以适合分离分子质量 60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为 X 用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为： (Met)-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-GlySei^Arg-Arg-Thi^Leu 。 3.2半成品检定 3.2.1 生物学活性 应按经批准的方法预处理供试品，依法測定（附录 C).应符合规定。 3.2.2 无菌检査 应按经批准的方法预处理供试品，依法检査（附录 M A), 应符合规定。 3.3成品检定 除外观、装S检査外，应按经批准的方法预处理供 试品后，进行其余各项检定。 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（附录聊A)或免疫斑点法（附录 V B B)測定，应为阳性。 3.3.2 物理检査 3.3.2.1 外观 应为透明水凝胶剂。 3.3.2.2 装 S 依法检査（附录I M).应符合规定。 3.3.3 化学检定 pH 值 应为5.0 7.5 ( 附 录 V A )。 0。 3.3.4 生物学活性 应 为 标 示 量 的 8 0 % ~ 1 5 0 % (附录 X 3.3.5 微生物限度检査 依法检査（附录 M 360nm下进行扫描， G )，应符合规定，
一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法[发明专利]
![一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/8594dadb5ff7ba0d4a7302768e9951e79b89696a.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010987897.7(22)申请日 2020.09.18(71)申请人 深圳科兴药业有限公司地址 518052 广东省深圳市南山区科苑路15号科兴科学园D1栋36层(72)发明人 周新荣 习海锋 张雷 马鸿杰 柏江涛 潘志友 (74)专利代理机构 广东金泰智汇专利商标代理事务所(普通合伙) 44721代理人 江丽娇(51)Int.Cl.C12P 21/02(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(54)发明名称一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法(57)摘要本发明提供了一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，属于发酵工程技术领域。
本发明以重组大肠杆菌BL21为发酵菌株，通过一级种子培养和二级种子培养后，接种至大肠杆菌培养基进行发酵培养，当OD 1.0600达到5.0~20.0后，添加诱导剂进行降温诱导，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h 为止。
本发明对培养基、培养工艺、诱导条件进行了集中改进；基于优化的发酵配方及培养条件，使培养效果得到显著提升；同时，发酵过程中进行降温诱导，促使蛋白正确折叠，发酵产物活性高。
本发明所得的发酵产物，其中重组人干扰素α2b的生物学活性可达3.18×108IU/ml，同时其工艺稳定，具有突出的技术优势。
权利要求书1页 说明书4页CN 111996225 A 2020.11.27C N 111996225A1.一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，包括：以重组大肠杆菌BL21为发酵菌株，通过一级种子培养和二级种子培养后，接种至大肠杆菌培养基进行发酵培养，当OD 1.0600达到5.0~20.0后，添加诱导剂进行降温诱导，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。
人干扰素α—2b生产工艺的研究
人干扰素α—2b生产工艺的研究
阎玉清;巫爱珍
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】1996(012)001
【摘要】人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵
技术,不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序,以及大肠杆菌表达的人干扰素α-2b包
涵体蛋白的天然构型复性等问题,从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得1000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为1×10~8u/mg,设备投资少,生产成本低,产
品表现了高纯度、高效价。
适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创
造了条件。
【总页数】5页(P23-27)
【作者】阎玉清;巫爱珍
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】TQ464.7
【相关文献】
1.重组人干扰素α-2b水针、粉针的稳定性及与干扰素标准品的比较研究 [J], 于
建春;谷峰;孙彦
2.重组人干扰素α2b阴道泡腾胶囊治疗宫颈人乳头瘤病毒感染的临床研究 [J], 董艳
3.膦甲酸钠联合重组人干扰素α2b治疗宫颈人乳头瘤病毒持续感染的临床研究 [J],
李翠
4.应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用 [J], 舒跃龙;周蕊;刘丽琦;史智扬;朱凤才;赵静;李刚;唐震;林里卓;张丽兰;侯云德
5.人α-干扰素2b基因转化番茄、番木瓜的研究(Ⅰ)──—人α-干扰素2b基因植物表达载体构建方法的研究 [J], 周鹏;赵志英;郑学勤
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请设计干扰素a2b的发酵工艺规程
请设计干扰素a2b的发酵工艺规程1、对重组人干扰素a2b或该制剂的任何成份有过敏史者禁用。
2、患有严重心脏疾病者禁用。
3、严重的肝、肾或骨髓功能不正常者禁用。
4、癫痫及中枢神经系统功能损伤者禁用。
5、有其他严重疾病不能耐受本品者，不宜使用。
[成份]主要成份为重组人干扰素a2b，由高效表达人干扰素a2b。
基因的腐生型假单胞菌，经发酵、分离和高度纯化制成。
辅料为人血白蛋白，甘露醇、磷酸氢二钠、酸二氢钠。
[性状] 应为白色薄壳状琉松体，加入标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
[适应症]1、用于治疗某些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣。
2、用于治疗某些肿瘤，如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴痛、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、喉乳头状瘤、卡波氏肉瘤、卵巢癌、基底细胞癌、表面膀胱癌等。
[规格]按不同规格分别为1X106IU,支，3X106IU/支，5X106IU/支，6X106IU/支，复溶后体积1、0毫升。
[用法用量]本品可以肌肉注射、皮下注射和病灶注射。
1、慢性乙型肝炎: 皮下或肌肉注射，3--6x106IU/日,连用四周后改为3次/周，连用16周以上。
2、急慢性丙型肝炎:皮下或肌肉注射,3--6x106IU/日,连用四周后改为3次/周，连用16周以上。
3、丁型肝炎: 皮下或肌肉注射，4-5x106TU/日,连用四周后改为3次/周，连用16周以上。
4、带状疱疹: 肌肉注射，1x1061U/日，连用6天，同时口服无环鸟苷。
5、尖锐湿疣: 可单独应用，肌肉注射，1-3x1061U/日，连用四周。
也可与激光或电灼等合用，一般采用疣体基底部注射，1x1061U/次。
6、毛细胞性白血病: 2-8x 1061U/m2天，连用至少3个月、7、慢性髓细胞性白血病: 3-5x1061Um2天，肌肉注射。
可与化疗药物羟基脲、Ara-c等合用。
8、多发性骨髓瘤:作为诱导或维持治疗，3-5x1061U/m2,肌肉注射，3次/周，并与VMCP等化疗方案合用。
大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2a的发酵工艺
大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2a的发酵工艺王思勤;张宏伟;刘志红;金磊【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2004(030)004【摘要】目的:探索获得大肠杆菌的高密度发酵和高效表达分泌型重组人干扰素α-2a的方法.方法:通过小试研究获得大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2a发酵的基本条件;通过中试研究碳源、氮源等营养物质补加的方式;同时就单独补充碳源、分别补充碳源和氮源的两种不同的发酵方式进行对比分析.结果:经优化后的发酵条件,最终菌体的光密度可达A600=70,分泌型重组人干扰素α-2a终产品为120 g·L-1菌体,平均比活性为2.2×108IU·mg-1蛋白.结论:获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFNα-2a的高表达条件.【总页数】4页(P636-639)【作者】王思勤;张宏伟;刘志红;金磊【作者单位】长春金赛药业有限责任公司,金赛增高研究所,吉林,长春,130012;长春金赛药业有限责任公司,金赛增高研究所,吉林,长春,130012;长春金赛药业有限责任公司,金赛增高研究所,吉林,长春,130012;长春金赛药业有限责任公司,金赛增高研究所,吉林,长春,130012【正文语种】中文【中图分类】Q813;R378.21【相关文献】1.分泌型人胸腺素α1基因工程菌高密度发酵工艺的研究 [J], 林陈水;黎小军;付水星;许明;梅建凤2.分泌型重组人干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎临床疗效和安全性研究 [J], 谢雯;马秀云;刘庄;李蕴铷;欧蔚妮;胥婕;杨玉英;段雪飞3.重组人干扰素α2a发酵工艺的研究 [J], 王树君;高明4.大肠杆菌发酵重组人干扰素—α2a的高密度,高表达 [J], 邹钟诚;侯剑英5.分泌型重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中试发酵工艺的研究 [J], 林殿海;杨桂云;迟春萍;李健平;赵丽欣;张秀霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组人干扰素α2a
注射用重组人干扰素α1b从干扰素最初发现到现在已经过去50年，当年英国科学家Isaacs和Lindenmann发现用加热灭活的流感病毒孵育小鸡尿囊绒膜会产生一种物质，它能对肝病毒的感染产生抵抗。
1957年,Proc R Soc Lond B Biol Sci刊登了他们的论文,在这篇论文中,Isaacs和Lindenmann将这种因子命名为干扰素(INTERFERON)。
从1980年代后期开始,借助分子生物学技术的发展,科学家们对干扰素的研究更加深入,各型干扰素、干扰素亚型及其功能逐渐为人们所认识,目前已经确认干扰素三种主要生物学作用为抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。
同时,由于DNA重组技术应用,干扰素制备技术也得到很大提高, 干扰素的研制经历了人白细胞干扰素、重组技术干扰素等阶段。
但在重组DNA技术发展和应用以前，分离纯化工艺的收率较低，而且有潜在病毒污染的危险。
1981年重组DNA技术的成功,提供了一种经济的方法得以产生大量纯化的重组人干扰素。
【1】干扰素是一组多功能的细胞因子，根据其氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为三类：IFN-α, IFN-β和IFN-γ。
α干扰素为多基因产物，分为许多亚型，其中IFN-α1b主要用于抗病毒治疗、抑制和杀伤肿瘤细胞以及免疫调节。
《中国生物制品规程》1995年版开始收载细胞因子类制品，分别是“冻干精制人白细胞干扰素”，“冻干基因工程干扰素α1b”, “冻干基因工程干扰素α2a”。
“冻干精制人白细胞干扰素”是用特定的诱生剂诱导健康人白细胞，经提取后制成的冻干干扰素。
由于该制品生产原料来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵，并且具有血源性病毒污染的潜在风险，随着基因工程干扰素的出现已被淘汰，《中国生物制品规程》2000年版不再收载该制品。
从《中国生物制品规程》2000年版起，采用重组DNA技术生产的干扰素α1b制品命名为“重组人干扰素α1b”。
基因工程干扰素α1b是通过重组DNA技术将人干扰素α1b的编码基因引入某种工程菌（大肠杆菌）后，高效地表达该基因产物，再经分离、纯化、冻干制得。
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大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵作者：丁少云指导老师：江诚(安徽医学高等专科学校，安徽合肥，231000)摘要：目的: 探索获得大肠杆菌的高密度发酵和高效表达分泌型重组人干扰素α-2b 的方法。
方法: 通过小试研究获得大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2b 发酵的基本条件; 通过中试研究碳源、氮源等营养物质补加的方式;同时就单独补充碳源、分别补充碳源和氮源的两种不同的发酵方式进行对比分析。
结果: 经优化后的发酵条件, 最终菌体的光密度可达A 600 = 70, 分泌型重组人干扰素α-2b 终产品为120 g· L - 1菌体, 平均比活性为2.2×108 IU ·m g- 1蛋白。
结论: 获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFN α-2b 的高表达条件。
关键词：重组人干扰素α-2b; 大肠杆菌; 发酵1.引言干扰素α-2b (interferonα-2b, IFNα-2b) 是由165 个氨基酸组成的单链多肽, 理论分子量为19219, 由两对二硫键构成, 有一定空间结构, 其中29-138位的二硫键对于维持活性尤其重要[ 1 ] 。
干扰素是最早通过基因工程技术表达的蛋白质之一。
利用传统的胞内表达方法有一定的缺陷, 如蛋白始终以还原状态存在, 无法形成正确的三级结构。
本课题组利用分泌型表达技术构建的IFNα-2b工程菌,使所表达的外源蛋白直接分泌于细菌的细胞间质中, 有利于蛋白质纯化; 同时, 所表达的蛋白同天然IFNα-2b有相同的一、二、三级结构, 因此有100%的生物学活性。
本实验研究了大肠杆菌重组人IFNα-2b的发酵工艺,对比单独补充碳源、同时补充碳源和氮源的两种不同方式的发酵方法, 获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFNα-2b的高表达条件。
2.材料与方法2.1 菌种工程菌为E .coli JM 101, 基因型F -m crA m crB IN (rrnD -rrnE ) lam da, 来自A T C C ;IFN α-2b cD N A 来自安徽农业大学免疫学教研室; 用于构建表达质粒的起始质粒P S T Ⅱ其结构包括碱性磷酸酶启动子(phoAprom oter)、翻译增强子序列、SD序列、S T Ⅱ信号肽序列、A m p 及T et抗性基因、复制起点。
2.2 发酵罐B .B raun 5 L 发酵罐、A pplican 40 L发酵罐。
2.3 培养基①种子培养基: L B 培养基; ②筛选培养基(g· L - 1 ): 葡萄糖2 g、酵母粉1.2 g、蛋白胨15 g、N aC l 1.2 g 、N H 4 C l 0.96 g、M gSO 4· 7H 2 O0.494 g、调pH 至7.5; ③发酵基本培养基(g· 10 L - 1 ) N aH 2 P O 4· 2H 2O 8.5 g、K 2 H P O 4 ·3H 2O 22.3 g、(N H 4 )2 SO 4 42 g、M gSO 4· 7H 2 O12 g 、葡萄糖10 g、酵母粉50 g、蛋白胨36 g、柠檬酸三钠9.65 g, 微量元素5 m L 。
其中微量元素混合物成分: F e、C o、M o、Zn 、C u、M n、B 等; ④补料:a. 50% 葡萄糖(105℃灭菌20 m in );b . 蛋白胨45 g,酵母粉14 g, 溶解于1 L 水中; c. 采用单独流加葡萄糖方法, 需在每升发酵基本培养基中另加入蛋白胨4.5 g, 酵母粉1.4 g。
使用发酵罐培养时, 不应加入任何抗生素。
2.4 检测方法通过SDS -P A G E 电泳, 并经V D S扫描仪分析IFNα-2b的表达量; 通过尿糖检测试剂盒检测发酵培养过程中糖的变化; 中试发酵结果的研究采用低渗裂解方法,并通过SDS -P A G E 电泳法检测蛋白量; 对40L发酵罐中试结果的分析, 均采用统一的纯化工艺路线; 终产品检测方法及质量标准符合《中国药品生物制品检定规程》(2000 版) 有关规定。
2.5 大肠杆菌重组人IFNα-2b发酵基本条件发酵基本条件的摸索采用摇瓶完成, 通过SDS -P A G E检测IFNα-2b表达量来决定发酵基本条件的优劣。
小试实验条件相同: 划L B 平板(含Tet,37℃培养过夜), 挑取单克隆, 接种于10 ml 液体培养基中(含Tet)。
37℃培养至A600 在1.5 左右, 分别进行下面的不同实验, 每组实验均采用筛选培养基, 接种量均为5% , 摇床转速220 r·min- 1 。
2.6 发酵培养周期通过分泌型表达技术构建的工程菌, 结构中包括碱性磷酸酶启动子(phoAprom oter), 其特点是随着培养基中磷酸盐的逐渐消耗, 出现低磷酸盐条件时, 开始诱导表达分泌IFNα-2b。
采用5 L 发酵罐和发酵培养基, 采用单流加葡萄糖补料, 并控制比生长速率。
在37℃、pH 7.0、保持溶解氧不低于30% 的发酵培养条件下, 确定IFNα-2b工程菌的发酵周期。
2.7 中试发酵工艺研究中试发酵工艺是在5 L发酵罐结果基础上进行线性放大, 采用40 L 发酵罐进行研究。
既往关于采用流加补料的形式获得相对高密度的发酵结果的研究已经很多, 故未将其列入,而重点研究单补糖及补糖、补氮结合的流加方式的比较。
将发酵工程菌划种L B 平板, 37℃培养过夜, 挑单菌落, 接种于10ml L B (含Tet) 的三角瓶中, 37℃培养至A600 = 1.0, 再在摇瓶中(含Tet) 放大培养至A600 = 2.0, 作为种子液。
按5%接种量接种于发酵培养基中, 进行中试发酵。
①连续流加葡萄糖方法补料: 控制罐压小于0.2 bar; 调节搅拌速度为200～1000 r·min- 1 ; 通气量始终保持溶解氧在30% 以上; 通过流加氨水控制pH = 7.0;通过糖检测试剂盒检测发酵罐中葡萄糖含量。
当罐中原有葡萄糖被耗尽时,开始以2.5 g· L - 1· h- 1 的速度补充葡萄糖, 并逐步增加到8.5 g· L - 1· h - 1 ,此后一直保持在5 g· L - 1· h- 1 直至发酵终止。
②连续流加葡萄糖及氮源方法补料: 补糖及检测方式同连续流加葡萄糖方法, 同时流加补料c, 进入稳定期前, 补料c 的流速为补糖流速的1/2, 进入稳定期后, 流速与补糖流速一致。
3.结果3.1 发酵基本条件的确定①温度对发酵结果的影响:取50ml 摇瓶(带机制档板),分别加入10ml表达培养基, 接入种子液, 分别放置于28℃, 33℃及37℃培养(图1), 说明发酵最适温度为37℃;②溶解氧对发酵结果的影响: 分别采用普通摇瓶及特制内部带有挡板的摇瓶对工程菌进行培养及诱导表达(特制内部带有挡板的摇瓶在同样转速下比普通摇瓶能提供更好的溶解氧, 图2), 表明高溶解氧有利于目标蛋白表达; ③pH 值对发酵结果的影响:取50ml摇瓶(带机制档板),分别加入10ml表达培养基, 接入种子液, 培养基起始pH 值分别为6.0、7.0 和8.0 (图3), 表明发酵最适pH 值为7.0。
根据上述结果, 本研究确定IFNα-2b发酵的基本条件: 温度37℃, pH 7.0 左右, 保持较高的溶解氧, 有利于目的蛋白的表达及分泌。
3.2 发酵培养周期根据摇瓶实验的结果,结合发酵其他分泌型工程菌的经验, 本研究确定的IFNα-2b 的发酵基本条件:温度37℃, pH 6.5～7.5,溶解氧不低于30% 。
在发酵过程中, 定时取样, 通过镜检监控大肠杆菌生长情况;通过SDS -P A G E 结果来确定表达开始时间及表达量, 初步确定IFNα-2b的发酵周期为22 h, 结果见图4。
3.3 中试发酵工艺通过控制碳(C) 源、氮(N)源的流加速度, 很容易控制比生长速率, 减少有机酸的积累,获得高密度发酵并使目标蛋白高表达,结果见图5和6。
从多次中试发酵实验结果分析, 分别补充碳源和氮源优于单补碳源, 结果见表1。
经优化后的发酵条件, 光密度达A600 = 70, 重组人IFNα-2b 终产品为120g· L - 1 菌体, 平均比活性为2.2×108 IU · m g- 1 蛋白。
4.讨论对一个有商业潜质的蛋白类药物的研究, 主要是要寻找一条稳定的工艺条件和获得较高的工作效率, 因此在高密度发酵过程中对培养基、补料方式及补料时机的选择就变得十分重要。
通过分泌型技术表达的蛋白质, 采用流加葡萄糖的补料方式优于批发酵[ 3 , 4 ] 。
但在实际发酵工作中, 对于不同的表达体系及不同的蛋白类型来说,面临的问题都不同。
要求培养基的营养物质比例要恰当, 如碳氮比值(C /N )偏小, 菌体虽然生长旺盛但确会提前衰老自溶; 若C /N 偏大, 则菌体繁殖较慢, 代谢不平衡[ 4 ] 。
因此在实际工作中, 实现高密度培养并高表达的报道较少。
Fig. 1 T he expressions of IFNα-2b/W 3110 in differen ttemperatures(SDS -P A G E )Lane 1 :Pro teinmarker;Lane 2: 2 8℃;Lane 3 :3 3 ℃ ; Lane 4 :3 7℃Fig .2 The expressions of IFN α-2b/W 3110 in different D O2Lane 1: Pro teinmarker; Lane 2: Special conical flask ; Lane 3 :Normal conical flaskFig . 3 The expressions of IFNα-2b/W 3110 in different p Hvalu esLane 1 :Pro tein Mark er; Lane 2 : pH = 6. 0 ;Lane 3: p H = 7. 0 ;Lane 4 :p H = 8 .0 ; Lan e 5 :IF N α-2 b standardFig .4 T h e expressions of IF N α-2b/W 3110 in differenttim eLane 1 :1 h ou r;L an e 2: 4 h o u rs; Lane 3 : 8 h o u rs;Lane 4 :1 3 h o u rs; Lane 5 : 14 h ou rs;Lane 6: 1 7 h o u rs;Lane 7 :1 9 h o u rs; Lane 8 : 22 h ou rs;Lan e 9: IF N α-2b standardFig . 5 T h e alteration o f pH -T of two different feedingm ethodsFig .6 T he alteration of A 600 -T of two differen t feedingm ethods高密度发酵时表达量下降的原因可能与代谢副产物(主要是乙酸等有机酸) 的积累有关[ 2 ] , 而有机酸的积累又与葡萄糖的利用有关。