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高二生物选修1 血红蛋白的提取和分离一、课题目标：1、通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。
2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
二、过程：（一）基础知识1、凝胶色谱法①凝胶色谱法的原理？②凝胶色谱法有哪些用途？③凝胶色谱法分离过程？2、缓冲液①缓冲液的组成、作用？②试说说人体血浆中的PH能够保持稳定与什么物质有关？3、电泳①蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度与所带净电荷的多少以及分子大小的关系？如何消除电荷对蛋白质迁移速度的影响？②凝胶电泳法的原理？（二）实验操作1、蛋白质的提取和分离一般分为哪四步？2、洗涤红细胞的目的是什么？3、分离红细胞采用什么方法？4、血红蛋白和血浆蛋白哪种蛋白存在于内环境中？血红蛋白的作用？5、血红蛋白的释放的原理？6、如何除去血红蛋白溶液中无机盐和小分子有机物质？该方法的采用的原理是什么？7、根据凝胶色谱柱的装填步骤，试完成下表例题分析：1、某同学在实验课前从学校的附近的屠宰场取新鲜的猪血，并在采血容器中预先加入抗凝血剂檬酸钠，取血回来马上进行实验，请回答红细胞洗涤的有关问题：（1）你如何知道红细胞已洗涤干净？（2）分离红细胞时的离心速率及离心时间分别是（3）如若离心速率过大和时间过长，则结果会怎样？2、红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。
请回答下列有关问题：（1）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①加入柠檬酸钠的目的是②以上所述的过程即样品处理，它包括、、收集血红蛋白溶液。
（2）通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胺电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是什么？②血红蛋白有什么特点？这一特点对进行蛋白质的分离有何意义？巩固训练：一、单项选择题1、下列叙述不正确的是（）A、蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快B、蛋白质所带的电荷数越少，移动得越快C、电荷数相同时，颗粒越大，移动越慢D、电何数相同时，颗粒越小，移动越快2、下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是（）A、是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法B、在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，最后流出C、凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其空隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系D、一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来3、对凝胶电泳的相关认识错误的是（）A、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小B、蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小C、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离D、凝胶中加入SDS可以消除静电荷对迁移率的影响4、关于凝胶色谱柱的装填不正确的是（）A、交联葡聚糖凝胶（G—75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离X围，“75”表示凝胶得水值B、色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装C、用300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分地平衡凝胶12hD、凝胶用自来水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液5、在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（）A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密6、有关样品的加入和洗脱的叙述正确的是（）A、先加入1mL透析后的样品B、加样前要使缓冲液慢下降全部流出C、如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功D、洗脱时可以用缓冲液也可以用清水7、加有少量柠檬酸钠的猪血分装于①②③试管中，随后依次加入0.3%、0.9%和1.5%的氯化钠溶液稀释，30分钟后离心。
第5．3 血红蛋白的提取和分离【学习目标】凝胶色谱法的原理和方法样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填【基础知识预习】1．凝胶色谱法凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2．缓冲溶液缓冲溶液的作用是。
缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3．电泳电泳是指。
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。
4．蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。
【教学过程】【课题背景】：新华网首尔１２月２９日电（记者干玉兰）韩国浦项工业大学科学家２９日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“ＴＲＩＭ５”蛋白质核心部分的结构。
浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“ＴＲＩＭ５”蛋白质内核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。
研究成果发表在最新一期《分子细胞》杂志上。
2００４年英国《自然》杂志曾刊登论文说，“ＴＲＩＭ５”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。
此后，世界各地的很多科学家开始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。
课题3血红蛋白的提取和分离蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。
对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。
所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。
怎样提取蛋白质呢？(二)进行新课1.基础知识蛋白质的物化理性质：____________________________________________________________________ , 由此提取和分离各种蛋白质。
1.1凝胶色谱法(分配色谱法)：(1)原理：(图5- 13a)分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
(2)凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
(3 )分离过程：(图5 —13b)混合物上柱T T—分子流动快、—分子流动慢T收集—分子T收集__分子*洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1 . 2缓冲溶液(1 )原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3 —NaHCO 3, HC —NaC ,NaH2PO4/Na2HPO4 等)， __________________________________________________ 。
(2)缓冲液作用：__________________________________________________________ 。
1 . 3凝胶电泳法：(1)原理：不同蛋白质的__________________________________ 不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
(2) ____________________________________ 分离方法：。
(3)分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的____________________ 形成“蛋白质—SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅_______________________________ 。
2•实验设计2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么?22选择实验材料(1)你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么?(2)请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。
并思考回答下列问题：血液由和两部分组成。
血细胞中_______ 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 _______________ 。
该化合物是由_______ 和________ 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与Q和CQ结合的 _基团。
2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。
洗涤红细胞的目的是什么？__________________________________ ，有利于后续步骤的分离纯化。
红细胞的洗涤过程为血液+ ______________ T ___速短时离心T吸出上层血浆T红细胞+ 5倍体积生理盐水T缓慢搅拌10min T________________ 离心T吸出上清液T反复洗涤直至上清液无 ____________ 色思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止 _____ ;防止;防止______________ 。
思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来?加入____________________ ，用玻璃棒____________________ 一段时间。
补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。
加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。
怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：红细胞破碎混合液T—速—时离心（2000c/min x 10min滤纸过滤除去脂质宀分液漏斗分离出血红蛋白2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。
________ 。
半透膜的________ 性，大分子物质 _____ 能通过半透膜，离子和小分子__通过半透膜。
在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH=7的磷酸缓冲液中。
思考：为何使用pH= 7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。
但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。
怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤一一粗分离（凝胶色谱操作）。
2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作_______________ 、装填 __________ 、__________ 和_______根据教材图5 - 19,说出制作色谱柱需要的材料。
橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。
色谱柱的制作过程：准备材料T加工橡皮塞T安装色谱柱下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。
请阅读教材：色谱柱的装填过程。
样品加入和洗脱。
其基本过程是:调节缓冲液面T 加入蛋白质样品T 调节缓冲液面T 洗脱T 收集分装蛋白质 至此，血红蛋白即可得到粗分离。
在整个操作过程中，应当注意以下事项: （1 ）红细胞的洗涤：（2 ）凝胶的预处理：_______________________________________________________________ ? _________________________________________________________________________________（3 ）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
（4）色谱柱成功标志： ___________________________________ （三）课堂总结、点评（四）实例探究例i 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）A.相对分子质量大的 B.溶解度高的C. 相对分子量小的 D. 所代电荷多的例2蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 ☆综合应用例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（）A 路程较长，移动速度较慢B 路程较长，移动速度较快C 路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快（五）巩固练习1.凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（血 红蛋 白 的提 取 和 分 离蛋白质分子的差异性二凝胶色谱法 凝胶电泳法=1 缓冲溶液 提取分离=＞原纯度鉴定样品处理粗分离A. 对其他分子的亲和力B. 溶解度C. 所带电荷多少D. 相对分子质量的大小 2. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ） A. 糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸3. 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（ ） A. 血红蛋白是有色蛋白 B. 红细胞无细胞核 C. 红细胞蛋白质含量高 D. 红细胞 DNA 含量高4. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ） A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀5. 血红蛋白因含有（ ）而呈红色 A. 0 2B. COC. CO 2D.血红素B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可D. 透析时要用 20mmol/l 的磷酸缓冲液，透析 12h ）A. 先加入 1ml 透析后的样品B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出C. 如果红色带均匀一致的移动， 说明色谱柱制作成功D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水 8. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D. 可通过SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 9. 凝胶色谱法操作正确的是（）A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴B. 将橡皮塞下部切出凹穴C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片 10. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D. 用吸管小心的将 1ml 透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 ★课余作业 1、 你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？2、与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质的分离和提取有什么意 义？6. 下列操作正确的是（ ）A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 7. 样品的加入和洗脱的叙述正确的是（。
