下载文档原格式
第三节蛋白质的理化性质及其分离纯化一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离（二）蛋白质的胶体性质（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应（一）蛋白质的两性电离蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，因此在不同pH的介质中，蛋白质的带电状态就不同。
PrNH3+COOHPrNH3+COO-PrNH2COO-O H-H +O H-H +兼性离子pH=pI阳离子pH<pI 阴离子pH>pI蛋白质的等电点（pI）•概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
•pI是蛋白质的特征性常数。
•利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。
•pH >pI 带负电荷•pH <pI 带正电荷•体内多数蛋白pI为5.0左右，pH为7.45 时多数蛋白带负电荷。
•如pI 偏于碱性－碱性蛋白质鱼精蛋白组蛋白•如pI 偏于酸性－酸性蛋白质胃蛋白酶丝蛋白（二）蛋白质的胶体性质•颗粒大小：在1～100nm之间。
属胶体。
因此溶于水，成为亲水胶体。
•稳定亲水胶体的因素：水化膜表面电荷不通透性：半透膜毛细血管壁------------++++++++++++------------（三)蛋白质的变性、沉淀和凝固1.变性（denaturation）•概念: 在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。
•变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。
天然状态，有催化活性非折叠状态，无活性，二硫键被还原天然状态，二硫键恢复，而且正确配对尿素或2-巯基乙醇去除变性因素核糖核酸酶•变性因素：物理因素：加热、加压、超声波、紫外线化学因素：胍、脲、有机溶剂、强酸强碱、SDS-巯基乙醇、重金属离子生物碱试剂•蛋白质变性后的理化和生物学性质改变：溶解度↓生物活性丧失及易被蛋白酶水解粘度↑结晶能力消失、•应用：消毒灭菌低温保存生物制剂•复性(renaturation)：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必需在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
化工学院生物工程一班胡冠南 3010207234蛋白质分离与纯化技术蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。
因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。
机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。
然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。
一．蛋白质分离的准备从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。
如果不能满足这一条件，蛋白将很快失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。
因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。
在不同的实验中所通到的困难各不相同，有的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定，在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。
在不同的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。
然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。
缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持—定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。
pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。
pH值是指溶液中氢离子浓度的负对数，pH＝-log(H+)。
pKa值是溶液中酸解离常数的负对数值。
溶液的pH值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强，离pKa值越远则缓冲能力越弱。
表1 常用缓冲液的pKa值a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。
※一般原则1）有条件时，应对pKa相近的一些缓冲液进行试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质分离纯化是生物学研究的基础，也是生物技术的重要内容。
蛋
白质的分离纯化包括各种技术，有基于物理性质的分离技术，基于化学性
质的分离技术，也有基于生物学性质的分离技术，以及结合物理学、化学
和生物学的复合分离技术。
（一）物理性质分离
物理性质分离是指根据蛋白质的热稳定性、电荷和非电荷性等物理性质，运用精馏、沉淀等方法来分离纯化蛋白质。
例如通过超速离心可以将
悬浮于溶液中的悬液分离出来；用电泳来分离稠浆状溶液中的粒状固体；
通过精馏来分离不同分子量的蛋白质；结构性蛋白质可以利用蒸发或热稳
定性差异进行分离；在高倍弥散能够分离多肽链；通过简单沉淀和浓缩等
技术也可以分离纯化蛋白质。
（二）化学性质分离法
化学性质分离法是指根据蛋白质的氨基酸组成、汞结合能力、还原性、可溶性等化学特性，运用离子交换色谱、酸-碱色谱、凝胶电泳、乙醇沉
淀等技术来分离纯化蛋白质。
蛋白质分离纯化的方式及基本原理
蛋白质分离纯化是指将蛋白质从混合物中分离出来，并将其纯度提高到足够高的水平，使其具备生物学或生化功能的过程。
蛋白质分离纯化的基本原理是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。
蛋白质分离纯化的基本步骤包括取样、提取、分离和纯化。
首先是取样，这是蛋白质分离纯化的第一步，其目的是从可用样品中取出一部分样品以进行分离纯化。
接下来是提取，这是蛋白质分离纯化的第二步，主要是将蛋白质从样品中提取出来，以便进行后续处理。
第三步是分离，这是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的有效分离。
最后是纯化，这是将分离的蛋白质的纯度提高到足够的水平，使其具备生物学或生化功能的过程。
蛋白质分离纯化的基本原理是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。
它是一个复杂的过程，涉及到各种技术，如沉淀、溶解、离子交换、硅胶等。
分离的基本原理是利用蛋白质的分子特性，如电荷、大小、结构等，在不同的溶剂环境中，蛋白质的分子结构、分子质量和电荷状态会发生变化，从而使蛋白质的分离和纯化变得可能。
蛋白质分离纯化是一个复杂的过程，涉及到多种技术，其基本原理
是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。
蛋白质分离纯化可以帮助我们更好地理解蛋白质的功能和结构，为后续的生物学研究和药物开发提供重要的信息。
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法文章出处：朱敏蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。
有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。
常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。
用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。
分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。
操作时的pH 值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。
有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。
一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol 左右, 过多不仅耗费有机溶剂, 而且可能导致沉淀不好. 沉淀的条件一经确定, 就必须严格控制, 才能得到重复性结果. 有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示. 故操作条件比盐析法严格。
许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。
其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。
某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。
有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。
在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。
根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。
因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。
分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。
疏水层析是近年发展的新方法。
它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。
洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。
