蛋白质不稳定性ppt课件

狭义的范德华力是一种很弱的作用力，而且随 非共价键合原子与分子间距离（R）的6次方的倒数而 变化。虽然就个别来说，范德华力是很弱的，但是范 德华相互作用数量大，并且具有加和效应和位相效应 （当分子或集团相同时，其瞬间偶极矩同位相，从而 产生最大的相互作用），因此，就成为一种不可忽视 的作用力。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（四）盐键： 又称盐桥或离子键。它是正电荷与负电荷之间的一种静电 相互作用。在生理pH下,蛋白质中的酸性氨基酸（天冬氨酸 和谷氨酸）的侧链可离解成负离子，碱性氨基酸（赖氨酸、 精氨酸和组氨酸）的侧链可离解成正离子。在多数情况下 这些基团都分布在球状蛋白质分子表面，而与介质水分子 发生电荷-偶极之间的相互作用，形成排列有序的水化层， 这对稳定蛋白质的构象有着一定作用。
疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强，但超过一 定温度后（50-60℃，因侧链而异），又趋减弱，因为超 过这个温度，疏水基团周围的水分子有序度降低，因而有 利于疏水基团进入水中。
非极性溶剂、去污剂是破坏疏水作用的试剂，因此是变性 剂。尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水作用，因 此是强变性剂。
（三）疏水作用：
水介质中球状蛋白质的折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在 分子的内部，这一现象称为疏水作用或疏水效应。它在稳 定蛋白质的三级结构方面占有突出地位。疏水作用其实并 不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或 疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。当然，当疏水基 团接近到等于范德华距离时，相互间将有弱的范德华引力， 但这不是主要的。蛋白质溶液中的熵增加是疏水作用的主 要动力。
三、环境因素对蛋白质稳定性的影响
物理因素：温度、紫外线照射、高压和表面张 力等；
化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸、碱等；如 尿素和盐酸胍，一方面能与多肽主链竞争氢键， 破坏蛋白质的二级结构；更重要的是它们可以 增加非极性侧链在水中的溶解度，因而降低了 维持蛋白质三级结构的疏水相互作用。
酶的作用：一些蛋白质分解酶类的作用。 微生物因素：微生物分解利用蛋白质进行生长
带电荷的侧链也在蛋白质分子内部出现，它们一般与其他 基团形成强的氢键，但是偶尔也有少数带相反电荷的侧链 在分子的疏水作用内部形成盐键。在疏水环境中，介电常 数比在水中低，相反电荷间的吸引力相应增大。当荷电侧 链从水中转移到分子内部时，它周围有序排列的水分子被 释放到介质水中，因此，盐键的形成不仅是静电吸引而且 也是熵增加的过程。升高温度，可以增加盐桥的稳定性。 此外，盐键因加入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。
也可能是“地狱”。至于是“天堂”还是“地 狱”，主要取决于沉积的包含体蛋白质是否容易 复性。
1、包含体的体内抑制 对于那些难于复性的蛋白质（如相对分子量较大、
结构复杂和含有较多二硫键的蛋白质），包含体 的形成意味着表达系统的失败，必须着力于胞内 可溶性蛋白质表达的研究，避免包含体的形成， 提高可溶性蛋白质的表达量，即包含体的体内抑
主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉 淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如 温度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子 （分子伴侣）的作用。
五、包含体的形成与性质
现代研究表明：在大多数情况下，包含 体的形成是蛋白质过量表达的结果，而 与蛋白质的种类和表达系统无关，即包 含体的形成与其相对分子质量、疏水性 以及折叠途径等内在性质没有必然的联 系。换句话说，对于任何蛋白质和任何 表达系统，在过量表达的情况下都可能 形成包含体。
五、包含体的形成与性质
2．以包含体形式表达重组蛋白质的优势 （1）包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿
主细胞的原核细胞表达系统中形成，而大肠 杆菌生长速度快，易于高密度培养，有利于 大规模生产目标蛋白质；
（2）包含体是在过量表达的情况下形成的， 因此一般包含体蛋白质的表达量都很高；
（3）包含体富含目的基因表达产物，有利 于后续的分离纯化。在适宜的包含体提取和 纯化条件下，目标产物纯度可达90%以上；
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（二）范德华力（范德华相互作用）： 广义的范德华力包括3种较弱的作用力，即：
定向效应：发生在极性分子或极性基团之间，它是永 久偶极间的静电相互作用，氢键可被认为属于这种范 德华力；
诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是 永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相 互作用；
2、包含体通常位于细胞质中，而一些分 泌性蛋白质可能在外周胞质中形成。
3、包含体的主要成分为基因表达产物， 占包含体的50%以上，其他成分因表达系统 而异，包括磷脂、微量的质粒、rRNA和RNA 聚合酶，更多的是黏附于包含体颗粒的外 膜蛋白质。
六、包含体的分离纯化与溶解
1、包含体的分离 包含体分离的最常用的方法就是：机械
对于以包含体形式表达的蛋白质，需要在分离回 收包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在 合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和 生物活性，这一过程称为蛋白质的体外再折叠或 复性。
五、包含体的形成与性质
(一)包含体的形成 目前，关于包含体的形成机理尚不完全
清楚，一般认为包含体的形成是部分折叠的 中间态之间疏水性相互作用的结果。
4、钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性； 5、选择合适分离方法。如：凝胶过滤、离子 交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。
五、包含体的形成与性质
重组蛋白质的过量表达常常导致其在胞内发生错 误折叠和聚集，形成被称为包含体的集聚体。
包含体主要是由蛋白质构成，其中大部分是基因 表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确 的，但立体结构是错误的，所以没有生理活性。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（五）二硫键： 二硫键的形成并不规定多肽链的折叠。
然而一旦蛋白质采取了它的三维结构， 则二硫键的形成将对此构象起稳定作用。 同一个蛋白质中，有些二硫键是生物活 性所必需的，另一些二硫键则不是生物 活性所必需的，但与维持蛋白质的稳定 有关，假如蛋白质中所有的二硫键相继 被还原，将引起蛋白质的天然构象改变 和生物活性丢失。
氢键 13-30KJ/mol-1 范德华力 4-8 KJ/mol-1 疏水作用 12-20 KJ/mol-1 （注意：疏水作用的
数值表示在25℃非极性侧链能够从蛋白质内部转 移到水介质中所需的自由能，它与其他键的键能 不同，此数值在一定范围内随温度的升高而增加。 实际上它并不是键能，此能量的大部分并不用于 伸展过程中键的断裂。） 盐键 12-30 KJ/mol-1 二硫键 210 KJ/mol-1
以包含体形式表达重组蛋白质的优势
（4）沉积于包含体内的目标蛋白质不 易被蛋白酶水解；
（5）对于那些对宿主细胞有毒害作用 或杀伤作用的目的基因表达产物，以包 含体形式表达是最可取的生产途径。
五、包含体的形成与性质
（二）包含体的性质 1、包含体为高密度蛋白质聚集体，密度
约1.3g/ml.颗粒尺寸约0.1-1.0 μm ,有些 达3μm，对表达产物和表达系统而异。
蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高 级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的。而氨 基酸序列是由遗传物质DNA的核苷酸序列决定的。 肽键（CO-NH）是连接多肽链主链中氨基酸残基 的共价键，二硫键（-S-S-）是使多肽链之间交 联或使多肽链内成环的共价键。
一、蛋白质失活的机制
蛋白质不稳定（失活）的表现分为两种，即化学 不稳定和物理不稳定。
分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力， 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭 义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作 用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时 变化的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
瞬时偶极是由于所在分子或基团中电子电荷密度 的波动，即电子运动的不对称性造成的。瞬时偶极可 以诱导周围的分子或基团产生诱导偶极，诱导偶极反 过来又稳定了原来的偶极，因此它们之间产生了相互 作用。
化学不稳定是指蛋白质分子通过共价键的形成和 断裂形成新的化学实体；
物理不稳定指蛋白质分子的高级结构的物理转变， 无共价键改变。物理不稳定包括变性、聚集、沉 淀和表面吸附。
蛋白质一旦发生了化学不稳定，就会完全丧失其 原有生理活性，产生新的功能活性或完全丧失生 物活性。但物理不稳定现象一般可以通过特定的 途径恢复其空间结构，而恢复原有的活性，我们 称这一过程为蛋白质的复性。
五、包含体的形成与性质
（1）降低细胞培养温度，减缓蛋白质的表达 速度和降低表达量；
（2）将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶 和二硫键异构酶共表达，弥补外源蛋白质表达过 程中缺乏的辅助因子；
（3）使用非代谢性碳源，降低代谢速度和蛋 白质表达量；
(4)将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达， 常用的融合蛋白质有谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结 合蛋白和硫氧还原蛋白。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
蛋白质的天然折叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
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三、环境因素对蛋白质稳定性的影响
值得注意的是：蛋白质的变性是一个协 同过程，它是在所加变性剂的很窄浓度 范围内或很窄pH或温度间隔内突然发生 的。
四、分离纯化中保持蛋白质稳定的方法
1、尽量在相对密封和无菌的环境下快速进行 分离纯化操作；
2、在生理温度和压力范围内完成分离纯化操 作；
3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行 详细的试验，确定最佳添加量和条件；
第二章 蛋白质的不稳定性及对策