高级生物化学蛋白质性质和分离优秀课件
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蛋白质的理化性质与分离纯化
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
蛋白质详解,分类性质,生物化学课件完整版生物化学课件完整版(极其详细)
第二章蛋白质
第一节蛋白质的概念及其生物学意义
一、什么是蛋白质？
α—AA借肽键相连形成的高分子化合物（短杆菌肽含D-苯丙氨酸）
［肽键：—C—NH—也叫酰胺键］
二、蛋白质的生物学作用（或称功能分类）
物质吸收与运输、运动，调节代谢、储存养分、催化各种生化反应、分子间的识别（支架蛋白）、信息传递（受体复制酶）、记忆、疾病防御—抗体。
脑啡肽：许多有镇痛作用：C端Leu（Leu脑啡肽已人工合成）
（5肽）Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
促肾上腺皮质激素（ACTH 39肽，脑垂体分泌）、
胆囊收缩素（33肽，十二指肠分泌）括约肌收缩，胆汁分泌减少引起厌食(减肥)
胰高血糖素(29肽，胰岛α-细胞分泌)使糖原降解，血糖升高，与胰岛素相反。
用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。因为产生CO2，也可用CO2气体分析法测定aa（只限于α-氨基酸），肽和蛋白也有此反应，肽越大灵敏度越差。
⑶与亚硝酸的反应（aa的NH2基被氧化成—OH），+NH3—N被氧化成N2，HNO2—N被还原为N2，等量进行。所以N2一半来自HNO2（其他伯氨基均可）。
生成N2的反应叫vanslyke（范斯莱克）反应。
两边取负对数得2×—lg[H+]＝—lg K1＋—lgK2即：
pH=[pK1+pK2] / 2=pI
分子的存在状态是多种多样的，但在一定条件下以某一状态为主。
即aa的等电点pI就是两性离子(R0)两侧的pK值的平均值。基团的pK值可查得，故pI值可由二pK值计算得之。
对于有三个解离基团的aa，如Asp、Lys只要取其兼(两)性离子两侧的pK值的平均值即得pI值。
RRR
在电场中不移动，此时的pH称为aa的等电点（pI）。此时aa的溶解度最小（因为静电作用），pI与—COOH和—NH2的解离常数有关。
第一节蛋白质的概念及其生物学意义
一、什么是蛋白质？
α—AA借肽键相连形成的高分子化合物（短杆菌肽含D-苯丙氨酸）
［肽键：—C—NH—也叫酰胺键］
二、蛋白质的生物学作用（或称功能分类）
物质吸收与运输、运动，调节代谢、储存养分、催化各种生化反应、分子间的识别（支架蛋白）、信息传递（受体复制酶）、记忆、疾病防御—抗体。
脑啡肽：许多有镇痛作用：C端Leu（Leu脑啡肽已人工合成）
（5肽）Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
促肾上腺皮质激素（ACTH 39肽，脑垂体分泌）、
胆囊收缩素（33肽，十二指肠分泌）括约肌收缩，胆汁分泌减少引起厌食(减肥)
胰高血糖素(29肽，胰岛α-细胞分泌)使糖原降解，血糖升高，与胰岛素相反。
用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。因为产生CO2，也可用CO2气体分析法测定aa（只限于α-氨基酸），肽和蛋白也有此反应，肽越大灵敏度越差。
⑶与亚硝酸的反应（aa的NH2基被氧化成—OH），+NH3—N被氧化成N2，HNO2—N被还原为N2，等量进行。所以N2一半来自HNO2（其他伯氨基均可）。
生成N2的反应叫vanslyke（范斯莱克）反应。
两边取负对数得2×—lg[H+]＝—lg K1＋—lgK2即：
pH=[pK1+pK2] / 2=pI
分子的存在状态是多种多样的，但在一定条件下以某一状态为主。
即aa的等电点pI就是两性离子(R0)两侧的pK值的平均值。基团的pK值可查得，故pI值可由二pK值计算得之。
对于有三个解离基团的aa，如Asp、Lys只要取其兼(两)性离子两侧的pK值的平均值即得pI值。
RRR
在电场中不移动，此时的pH称为aa的等电点（pI）。此时aa的溶解度最小（因为静电作用），pI与—COOH和—NH2的解离常数有关。
生物化学课件-蛋白质及其分离纯化
• 构成蛋白质的基本氨基酸共20种。 构成蛋白质的基本氨基酸共20 20种 • 共同点：除脯氨酸外，均为α-氨 共同点：除脯氨酸外，均为α 基酸，即同一碳原子上有羧基、 基酸，即同一碳原子上有羧基、氨 基与氢。 基与氢。 • 不同点：侧链R基团不同。 不同点：侧链R基团不同。
3、氨基酸的分类
Ⅰ 蛋白质氨基酸
Hale Waihona Puke 补充： 补充：1.4.5 结构域：多肽链上由相邻的超 结构域：
二级结构单元联系而成的局部性区域 折叠成近乎球状的高级结构。 ，多肽链折叠成近乎球状的高级结构。
1.4 .6 蛋白质的三级结构
定义：建立在二级结构、超二级结构 建立在二级结构、 建立在二级结构 乃至结构域的基础上， 乃至结构域的基础上，一条多肽链 所有氨基酸残基的空间关系（ 中所有氨基酸残基的空间关系（构 象）。
1）20种基本氨基酸 ） 种基本氨基酸 按侧链极性分类 按侧链结构分类 按人体能否合成分类 2）稀有氨基酸 ）
Ⅱ 非蛋白质氨基酸
按侧链结构分类
脂肪族氨基酸(15种) 脂肪族氨基酸 种 芳香族氨基酸(3种 芳香族氨基酸 种) 杂环氨基酸(2种 杂环氨基酸 种)
芳香族氨基酸(3种 芳香族氨基酸 种)
Ⅱ β-折叠
定义： 两条或多 条几乎完 全伸展的 多肽链侧 向聚集在 一起， 一起，靠 链间氢键 联结的片 层结构
β－折叠的特征要点： 折叠的特征要点：
相邻肽链走向可平行也可反平行 平行也可反平行。 ① 相邻肽链走向可平行也可反平行。 肽链的N 端在同侧为平行式， 肽链的N-端在同侧为平行式，不在同侧 为反平行式。 为反平行式。从能量角度考虑反平行式 更为稳定 稳定性是靠链间氢键维持的， 链间氢键维持的 ② 稳定性是靠链间氢键维持的，氢键是 由相邻肽链主链上的N C=O之间形成 由相邻肽链主链上的N-H和C=O之间形成 的 氨基酸残基的R ③ 氨基酸残基的R侧链交替分布在片层 的上下两侧
生物化学课件 第7章 - 蛋白质分离纯化和表征(9-21)
思考题 2012年厦门大学生物化学
5. 一多肽有侧链羧基30个（pk1=4.3），咪唑基15个(pk2 =
6.0) ，氨基10个（pk3=10）。两端羧基，氨基的pk分别为
COOH = 3.5 和 NH3+ = 9.5。求该蛋白的PI值
+26
分析：
pk1=4.3
30 × COOH
+25
NH3+ pk1=9.5
当一种氨基酸的净电荷用q=pI-pH表达时，若q为正值，则 该氨基酸带正电荷；若q为负值，则该氨基酸带负电荷。
q值的正与负和该氨基酸所带电荷的种类是一致的。如 果采用q=pH-pI来表达，则会出现相反的结果，即q为负值时， 氨基酸带正电荷；q为正值时，氨基酸带负电荷。因此，用 pI-pH更好。
思考题
第7章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的理化性质 P291
（一）蛋白质的酸碱电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基 侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带 负电荷或正电荷的基团。
当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子 的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
试剂的酸根离子结合而产生沉淀。
生物碱试剂和某些酸类沉淀
实例分析
实例分析：在啤酒生产工艺中有麦芽汁加啤酒 花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的单 宁类物质怀变性蛋白质或盐形成沉淀，使麦芽 汁得以澄清，从而防止成品啤酒产生蛋白质混 浊。
“ 柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的 柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的 蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”
生物化学课件之蛋白质(共119张PPT)
缬氨酸 valine Val V
亮氨酸 leucine Leu L
异亮氨酸 isoleucine Ile I
苯丙氨酸 phenylalanine Phe F
脯氨酸 proline Pro P
目录
2. 极性中性氨基酸
色氨酸 tryptophan Try W
丝氨酸 serine
Ser S
酪氨酸 tyrosine Try Y
第一节 蛋白质是生命的物质基础
一、什么是蛋白质?
蛋白质(protein)是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键(peptide bond)相连 形成的高分子含氮化合物。
二、蛋白质的生物学重要性
1. 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：
普遍存在于生物界，动物、植物、微生物主要是由 蛋白质构成。
蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。
由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只 要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式 推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
二、氨基酸 —— 组成蛋白质的基本单位
赖氨酸 lysine Lys K
精氨酸 arginine Arg R
组氨酸 histidine His H
目录
几种特殊氨基酸
• 脯氨酸
（亚氨基酸）
半胱氨酸
+
-HH
二硫键
胱氨酸
（二）氨基酸的理化性质
1. 两性解离性质 2. 紫外吸收性质 3. 茚三酮反应
1. 两性解离及等电点
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的 酸碱度。
生物化学蛋白质化学(二)3PPT课件
6
生工学院生命科学系
等电点沉淀和电泳：
等电点沉淀：迁移率与净电荷量、 分子大小、分子形状等有关
电泳：带电粒子在电场中移动的
现象称为电泳
11.08.2020
7
生工学院生命科学系
蛋白质分子在一定pH的溶液中可带净 的负电荷或正电荷，故可在电场中发生 移动。
不同蛋白质分子所带电荷量不同，且分
子大小也不同，故在电场中的移动速度
可逆变性（三、四级结构）与不可逆 变性（二、三、四）
不是所有的变性蛋白都能复性。大部
分蛋白质变性后不能恢复其原有的各
种性质 11.08.2020
20
生工学院生命科学系
四、蛋白质的沉淀
改变稳定蛋白质胶体溶液的条件时，稳定性就
被破坏，蛋白质分子相聚集而从溶液中析出，
这种+现+ 象+ 称为H蛋+ 白质的沉淀OH-作用。- - -
表面电荷---- 在非等电点状态下，双电层，带
同性电荷蛋白质分子互相排斥。
11.08.2020
11
生工学院生命科学系
蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜
+++
酸
+
+碱
++
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
碱
－ －
－ －
酸 －－－ －
带负电荷的蛋白质
脱水作用
脱水作用
脱水作用
11.08.2020
12
4.蛋白质凝胶
生工学院生命科学系
凝胶具有胀润作用： 分类：（1）可逆性凝胶
（2）不可逆性凝胶
部分破坏水化膜、适当加热和远离等电点
11.08.2020
蛋白质化学—蛋白质的理化性质(生物化学课件)
第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱羧成醛， 放出CO2、NH3，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；
第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分 子和氨缩合生成有蓝色物质。
第一步 还原
O
H
C
OH
C
+ H2N C COOH
C
OH
R
O
O
C
OH
C
+
C
H
NH3 + CO2 + R
O
C H
O 还原型茚三酮
高温、高压
物理因素
紫外线、X射线、
变
性
电离辐射和超声波等
因
有机酸、生物碱
素
化学因素
有机溶剂、重金属盐
高浓度尿素、盐酸胍等
2024/4/13
28
变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响。
2024/4/13
29
变性蛋白 质 的特点
①生物学活性丧失
②理化性质改变 ③易被蛋白酶水解
空间结构改变
溶解度↓，沉降率↑
4.黄色反应
含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成
黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反
应式如下
NaOH
HO
+
HNO3
HO
O
NO2
N
O- Na+
硝基酚（黄色） O
邻硝醌酸钠（橙黄色）
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄色反应，苯丙氨酸 不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。
常用硫酸铵作分离蛋白质的盐析剂
3.醇沉分离法
醇沉法：利用杂质不溶于乙 醇的特性，在加入乙醇后，杂质 被沉淀出来的过程。
第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分 子和氨缩合生成有蓝色物质。
第一步 还原
O
H
C
OH
C
+ H2N C COOH
C
OH
R
O
O
C
OH
C
+
C
H
NH3 + CO2 + R
O
C H
O 还原型茚三酮
高温、高压
物理因素
紫外线、X射线、
变
性
电离辐射和超声波等
因
有机酸、生物碱
素
化学因素
有机溶剂、重金属盐
高浓度尿素、盐酸胍等
2024/4/13
28
变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响。
2024/4/13
29
变性蛋白 质 的特点
①生物学活性丧失
②理化性质改变 ③易被蛋白酶水解
空间结构改变
溶解度↓，沉降率↑
4.黄色反应
含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成
黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反
应式如下
NaOH
HO
+
HNO3
HO
O
NO2
N
O- Na+
硝基酚（黄色） O
邻硝醌酸钠（橙黄色）
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄色反应，苯丙氨酸 不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。
常用硫酸铵作分离蛋白质的盐析剂
3.醇沉分离法
醇沉法：利用杂质不溶于乙 醇的特性，在加入乙醇后，杂质 被沉淀出来的过程。
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高级生物化学蛋白 质性质和分离
一、蛋白质的变性与复性 P233
1. 蛋白质变性的概念 Denaturation 蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其
特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构 变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改 变和生物活性的丧失。 2. 变性的本质
次级键（有时包括二硫 键）被破坏，天然构象 解体。变性不涉及一级 结构的破坏
比较DNA和蛋白质变性的异同-2012中南大学生物化学
4、 DNA的熔解温度（Tm）
DNA的变性是爆 发式的，变性作 用发生在一个很 窄的温度范围内。
Tm
DNA的熔解温度（Tm）：
（1）定义：DNA的双螺旋结构失去一半时对应 的温度。
变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆 积，使Tm下降。 DNA的Tm一般在82—95℃之间
OD260增高 比旋度下降
酸碱滴定曲线改变
粘度下降 浮力密度升高 生物活性丧失
DNA的变性是爆发式的
增色效应
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。 DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基
础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。 变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫 外吸收，故产生增色效应。
Cot1/2＝１/K，即复性一半时的Cot值. （2）影响Cot1/2值的因素：不同的DNA 的Cot1/2值是不同的
与k值有关；而且DNA分子序列的复杂性影响K值． DNA分子序列的复杂性（X值）：
(1)定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值．
如（ATATAT）,其X值为2,（ATGC）（ATGC）n 的X值为4．
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程 称为退火(annealing) 。
2 DNA复性后的理化性质变化
减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低 粘度上升 浮力 密度降低 生物活性部分恢复
影响复性的因素
热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，
4. 变性的因素
① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波 ② 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。
（如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）
常用的变性剂：尿素
尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水 中的溶解度，从而降低疏水相互作用。
尿素或者胍
变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）
5、变性蛋白质的特性
• 生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变 性失去催化作用。
• 物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，密度降低， 失去结晶能力，旋光值改变，光谱发生变化。(分子量 不变）
• 化学性质改变，如结构的伸展松散而暴露，易与化学试 剂反应，易为蛋白质水解酶所分解。
制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
思考题
1. 酶在有底物存在时比没有底物存在时更稳定，解释 原因？-2012年山东大学生物化学
2. 二硫键多蛋白质难变性 3. 胶原蛋白有特殊共价键 4. 纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理？ 5、一般的酶都是低温保存，但低温不稳定性酶在低
温时变性，推测其机理。-2012年中山源自学生物化学 6. 酶敏感性的概念 ？
2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释 3、举例：
• 有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一 定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。
牛胰核糖核酸酶变性和复性
DNA的复性
1 DNA复性(renaturation)的定义
在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然 的双螺旋构象，这一现象称为复性。
-江南大学2009年生物化学
思考题
蛋白质变性后的现象
-2011四川大学生物化学
核酸的变性
P508
(一)、DNA的变性(denaturation)
1 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。
2 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、
酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等
3 变性后其它理化性质变化：
越远离此温度，复性速度就越慢
① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑
复性速度与DNA的浓度成正比 ⑤ 环状DNA易复性
复性速度可用Co·t衡量
Cot1/2值： （1）概念：当C/CO＝１/2时的Cot值定义为Cot1/2值，
变性理论和变性的因素
3.变性理论
1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后， 其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这 就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构 是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的 和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。
不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后， 其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的 DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。
假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变 性后A260nm上升30%以上
DNA和蛋白质变性的比较
DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降， 其过程不可逆。DNA变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键 完好，一般是可逆的。
（2）影响DNA熔解温度Tm值的因素: ① DNA均一性： ② G-C含量： G-C含量与Tm值成正比。 ③ 介质中离子强度：
7、蛋白质的复性
1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后， 可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分 恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 这种变性也称为可逆变性。
思考题
➢ 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 ➢ 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫
苗等）的必要条件。 ➢ 误服重金属解毒方式 ? ➢ 长期从事重金属作业的人吃高含蛋白质类食物 ？ ➢ 一种发生在蛋白质内部的Ala-Val突变导致蛋白质丧失活
性，然而，如果这种蛋白质在第二位置发生Ile-Gly的突 变，可使蛋白质恢复活性，试提出一种合理的解释。
一、蛋白质的变性与复性 P233
1. 蛋白质变性的概念 Denaturation 蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其
特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构 变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改 变和生物活性的丧失。 2. 变性的本质
次级键（有时包括二硫 键）被破坏，天然构象 解体。变性不涉及一级 结构的破坏
比较DNA和蛋白质变性的异同-2012中南大学生物化学
4、 DNA的熔解温度（Tm）
DNA的变性是爆 发式的，变性作 用发生在一个很 窄的温度范围内。
Tm
DNA的熔解温度（Tm）：
（1）定义：DNA的双螺旋结构失去一半时对应 的温度。
变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆 积，使Tm下降。 DNA的Tm一般在82—95℃之间
OD260增高 比旋度下降
酸碱滴定曲线改变
粘度下降 浮力密度升高 生物活性丧失
DNA的变性是爆发式的
增色效应
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。 DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基
础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。 变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫 外吸收，故产生增色效应。
Cot1/2＝１/K，即复性一半时的Cot值. （2）影响Cot1/2值的因素：不同的DNA 的Cot1/2值是不同的
与k值有关；而且DNA分子序列的复杂性影响K值． DNA分子序列的复杂性（X值）：
(1)定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值．
如（ATATAT）,其X值为2,（ATGC）（ATGC）n 的X值为4．
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程 称为退火(annealing) 。
2 DNA复性后的理化性质变化
减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低 粘度上升 浮力 密度降低 生物活性部分恢复
影响复性的因素
热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，
4. 变性的因素
① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波 ② 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。
（如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）
常用的变性剂：尿素
尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水 中的溶解度，从而降低疏水相互作用。
尿素或者胍
变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）
5、变性蛋白质的特性
• 生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变 性失去催化作用。
• 物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，密度降低， 失去结晶能力，旋光值改变，光谱发生变化。(分子量 不变）
• 化学性质改变，如结构的伸展松散而暴露，易与化学试 剂反应，易为蛋白质水解酶所分解。
制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
思考题
1. 酶在有底物存在时比没有底物存在时更稳定，解释 原因？-2012年山东大学生物化学
2. 二硫键多蛋白质难变性 3. 胶原蛋白有特殊共价键 4. 纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理？ 5、一般的酶都是低温保存，但低温不稳定性酶在低
温时变性，推测其机理。-2012年中山源自学生物化学 6. 酶敏感性的概念 ？
2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释 3、举例：
• 有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一 定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。
牛胰核糖核酸酶变性和复性
DNA的复性
1 DNA复性(renaturation)的定义
在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然 的双螺旋构象，这一现象称为复性。
-江南大学2009年生物化学
思考题
蛋白质变性后的现象
-2011四川大学生物化学
核酸的变性
P508
(一)、DNA的变性(denaturation)
1 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。
2 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、
酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等
3 变性后其它理化性质变化：
越远离此温度，复性速度就越慢
① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑
复性速度与DNA的浓度成正比 ⑤ 环状DNA易复性
复性速度可用Co·t衡量
Cot1/2值： （1）概念：当C/CO＝１/2时的Cot值定义为Cot1/2值，
变性理论和变性的因素
3.变性理论
1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后， 其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这 就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构 是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的 和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。
不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后， 其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的 DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。
假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变 性后A260nm上升30%以上
DNA和蛋白质变性的比较
DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降， 其过程不可逆。DNA变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键 完好，一般是可逆的。
（2）影响DNA熔解温度Tm值的因素: ① DNA均一性： ② G-C含量： G-C含量与Tm值成正比。 ③ 介质中离子强度：
7、蛋白质的复性
1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后， 可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分 恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 这种变性也称为可逆变性。
思考题
➢ 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 ➢ 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫
苗等）的必要条件。 ➢ 误服重金属解毒方式 ? ➢ 长期从事重金属作业的人吃高含蛋白质类食物 ？ ➢ 一种发生在蛋白质内部的Ala-Val突变导致蛋白质丧失活
性，然而，如果这种蛋白质在第二位置发生Ile-Gly的突 变，可使蛋白质恢复活性，试提出一种合理的解释。