核酸的物理化学性质和常用的研究方法
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酶水解 磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键的酶 核酸酶：特异性水解核酸的磷酸二酯酶叫 核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，核 酸内切酶，核酸外切酶（如 3’-或 5’-核苷酸酶） 非特异性的磷酸单酯酶对一切核苷酸 都能作用
18
五、核酸的分离与纯化
3、凝胶电泳 简单，快速，分离效果好，大小分 子都适用 凝胶电泳对核酸的分离作用主要依 赖于它们的分子量及分子构型，而凝胶 的类型及其浓度对被分离核酸的分子大 小关系重大
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PAGE
影响电泳迁移率的因素
1）分子大小：迁移率与分子量对数成反比 2）DNA的构象：超螺旋> 线型>开环DNA
3）胶浓度：迁移率与胶浓度成反比
4）电压或电流：在一定的电压范围内，迁 移率与电压或电流大小成正比
5）碱基组成：有一定影响
6）温度：4－30℃，常为室温
22
七、聚合酶链反应（PCR）
DNA－ DNA ，DNA－RNA
介质：液相，固相（硝酸纤维素膜）
14
Southern Blotting
E.M. Southern （1975）
DNA→酶解→电泳→变性 ↓ 洗涤←杂交←烘烤←转移 ↓ 放射自显影
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四、核酸的酸碱性质
1、酸碱性质 核酸具有较强的酸性 核酸可视为多元酸
碱基 稳定性
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五、核酸的分离与纯化
凝胶浓度与可分离的核酸片段分子量范围 胶浓度%
琼脂糖凝胶 电泳 0.1 0.6 0.8 1.0 1.5 2.4 5 15 20
分子量范围
1×107-5×108 1×106-4×107 1×106-2×107 5×105-1×107 1×105-5×106 3×104-1×106 1×104-5×105 1×103-1×105 3.3×102-3×104
低离子强度： Tm下降，熔解温度范围宽 高离子强度： Tm较高，熔解温度范围窄
11
三、核酸的变性、复性及杂交
5、RNA的变性
特点： Tm较低，变性 曲线较宽
tRNA的Tm较高 双链RNA的变性 与DNA相同
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（二）、复性（renaturation）
复性：在适当条件下，变性DNA的两条 链重新缔合成双螺旋结构的过程
A：光吸收值 C：磷的摩尔浓度 L：比色杯内径 W：每升溶液中磷的重量（g）
4
一、核酸的紫外吸收
DNA的ε(P)：6600 RNA的ε(P)：7700-7800
核酸的ε(P)比核苷酸单体低 单链多核苷酸的ε(P)比双螺 旋多核苷酸的ε(P)要高 增色效应：核酸变性时， ε(P)增加 减色效应：当核酸复性时， ε(P)降低
DNA：A260/A280 = 1.8；RNA：A260/A280 = 2.0
纯的核酸分子或寡核苷酸
A =1 50μg/ml 双螺旋DNA 40μg/ml 单链DNA(或RNA) 20μg/ml 寡核苷酸
3
一、核酸的紫外吸收
3、用摩尔磷消光系数ε(p)表示溶液中核酸的含量
碱基和磷原子含量相等，可以用P的含 量来表示核酸的含量 ε(p) = A/CL = 30.98A/WL
复性：物化性质和生物活性 DNA复性的影响因素 1、降温速度 退火：变性DNA缓慢冷却而复性的过程 2、DNA片段的大小 3、DNA的浓度 4、核苷酸顺序的复杂程度
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三、核酸的变性、复性及杂交
（三）、核酸的杂交（hybridization）
将异源DNA在同一体系中同时变 性，如果异源DNA彼此间有部分序列 相同，它们在复性时会形成杂交分子
DNA的密度与G-C 含量成正比
7
三、核酸的变性、复性及杂交
（一）、变性（denaturation） 1. 变性和降解
稀盐溶液
DNA的变性过程是双螺旋结构被 破坏，物化性质发生改变的过程
8
变性实质：氢键断裂，双链解体成单链 核酸的降解：多核苷酸骨架上共价键断裂， 因而引起核酸分子量的降低 氢键的破坏导致变性，共价键的破坏 导致降解
第十九章
核酸的物理化学性质 和常用的研究方法
1
核酸的物理化学性质
天然DNA分子细丝状的双螺旋结构 赋予DNA一系列显著的物化特性： 极大的粘度； 易于断裂； 易形成纤维状物质； 在稀盐溶液中热变性； 熔点高 RNA分子没有如此明显的物化特性
2
一、核酸的紫外吸收
1、核酸具有紫外吸收 吸收范围：240-290 nm λmax = 260nm （定量测定） 2、根据紫外吸收判断样品纯度 不纯的样品
5
二、核酸的沉降特性
溶液中的核酸受到引力作用会下 沉，不同构象的分子沉降速度有很大 差异 超速离心：分离纯化核酸 测定核酸的沉降系数 相对分子量 Nhomakorabea6
二、核酸的沉降特性
密度梯度超离心 分离RNA常用蔗糖梯度，分离DNA 常用CsCl梯度
实验室纯化质粒DNA： 染料（溴乙锭）-CsCl密 度梯度超离心，得到的 DNA纯度较高，可用于 DNA重组，测序及限制 酶图谱等
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五、核酸的分离与纯化
琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)
琼脂糖浓度：2.5 － 0.1% 分离片段大小：5×104－5×108 D
琼脂糖凝胶用于分析DNA较好，分析 RNA时易降解，必须加入蛋白质变性剂 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 胶的浓度：24 －2.4 % 分离片段大小：3.3×102－1×106 D PAGE可分析小于1000bp的DNA和RNA
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三、核酸的变性、复性及杂交
4. DNA的熔解温度Tm(melting temperature) DNA变性的特点：爆发式
DNA的熔点Tm 通过加热使DNA的 双螺旋结构解旋50％时 的温度
DNA的Tm：82 – 95℃
S形曲线－DNA的变性曲线
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三、核酸的变性、复性及杂交
影响Tm值的因素 ⅰ）DNA的均一性 ⅱ）G-C 含量 ⅲ）介质的离子强度
氢键
碱基 解离状态
溶液pH
溶液的pH直接影响着双螺旋结构的稳定 核酸是两性电解质，在不同pH溶液中的 解离程度不同。两性解离导致兼性离子的形 成，所以核酸也有等电点
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四、核酸的酸碱性质
2、核酸的水解 酸水解 糖苷键和磷酸二酯键都可以被酸水解： 糖苷键，嘌呤碱基的糖苷键，脱氧核糖， 脱氧核糖与嘌呤碱基形成的糖苷键 最不稳定，易于得到无嘌呤酸 碱水解 RNA在碱性条件下会产生2’- 核苷 酸和3’- 核苷酸
酶水解 磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键的酶 核酸酶：特异性水解核酸的磷酸二酯酶叫 核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，核 酸内切酶，核酸外切酶（如 3’-或 5’-核苷酸酶） 非特异性的磷酸单酯酶对一切核苷酸 都能作用
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五、核酸的分离与纯化
3、凝胶电泳 简单，快速，分离效果好，大小分 子都适用 凝胶电泳对核酸的分离作用主要依 赖于它们的分子量及分子构型，而凝胶 的类型及其浓度对被分离核酸的分子大 小关系重大
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影响电泳迁移率的因素
1）分子大小：迁移率与分子量对数成反比 2）DNA的构象：超螺旋> 线型>开环DNA
3）胶浓度：迁移率与胶浓度成反比
4）电压或电流：在一定的电压范围内，迁 移率与电压或电流大小成正比
5）碱基组成：有一定影响
6）温度：4－30℃，常为室温
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七、聚合酶链反应（PCR）
DNA－ DNA ，DNA－RNA
介质：液相，固相（硝酸纤维素膜）
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Southern Blotting
E.M. Southern （1975）
DNA→酶解→电泳→变性 ↓ 洗涤←杂交←烘烤←转移 ↓ 放射自显影
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四、核酸的酸碱性质
1、酸碱性质 核酸具有较强的酸性 核酸可视为多元酸
碱基 稳定性
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五、核酸的分离与纯化
凝胶浓度与可分离的核酸片段分子量范围 胶浓度%
琼脂糖凝胶 电泳 0.1 0.6 0.8 1.0 1.5 2.4 5 15 20
分子量范围
1×107-5×108 1×106-4×107 1×106-2×107 5×105-1×107 1×105-5×106 3×104-1×106 1×104-5×105 1×103-1×105 3.3×102-3×104
低离子强度： Tm下降，熔解温度范围宽 高离子强度： Tm较高，熔解温度范围窄
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三、核酸的变性、复性及杂交
5、RNA的变性
特点： Tm较低，变性 曲线较宽
tRNA的Tm较高 双链RNA的变性 与DNA相同
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（二）、复性（renaturation）
复性：在适当条件下，变性DNA的两条 链重新缔合成双螺旋结构的过程
A：光吸收值 C：磷的摩尔浓度 L：比色杯内径 W：每升溶液中磷的重量（g）
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一、核酸的紫外吸收
DNA的ε(P)：6600 RNA的ε(P)：7700-7800
核酸的ε(P)比核苷酸单体低 单链多核苷酸的ε(P)比双螺 旋多核苷酸的ε(P)要高 增色效应：核酸变性时， ε(P)增加 减色效应：当核酸复性时， ε(P)降低
DNA：A260/A280 = 1.8；RNA：A260/A280 = 2.0
纯的核酸分子或寡核苷酸
A =1 50μg/ml 双螺旋DNA 40μg/ml 单链DNA(或RNA) 20μg/ml 寡核苷酸
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一、核酸的紫外吸收
3、用摩尔磷消光系数ε(p)表示溶液中核酸的含量
碱基和磷原子含量相等，可以用P的含 量来表示核酸的含量 ε(p) = A/CL = 30.98A/WL
复性：物化性质和生物活性 DNA复性的影响因素 1、降温速度 退火：变性DNA缓慢冷却而复性的过程 2、DNA片段的大小 3、DNA的浓度 4、核苷酸顺序的复杂程度
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三、核酸的变性、复性及杂交
（三）、核酸的杂交（hybridization）
将异源DNA在同一体系中同时变 性，如果异源DNA彼此间有部分序列 相同，它们在复性时会形成杂交分子
DNA的密度与G-C 含量成正比
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三、核酸的变性、复性及杂交
（一）、变性（denaturation） 1. 变性和降解
稀盐溶液
DNA的变性过程是双螺旋结构被 破坏，物化性质发生改变的过程
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变性实质：氢键断裂，双链解体成单链 核酸的降解：多核苷酸骨架上共价键断裂， 因而引起核酸分子量的降低 氢键的破坏导致变性，共价键的破坏 导致降解
第十九章
核酸的物理化学性质 和常用的研究方法
1
核酸的物理化学性质
天然DNA分子细丝状的双螺旋结构 赋予DNA一系列显著的物化特性： 极大的粘度； 易于断裂； 易形成纤维状物质； 在稀盐溶液中热变性； 熔点高 RNA分子没有如此明显的物化特性
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一、核酸的紫外吸收
1、核酸具有紫外吸收 吸收范围：240-290 nm λmax = 260nm （定量测定） 2、根据紫外吸收判断样品纯度 不纯的样品
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二、核酸的沉降特性
溶液中的核酸受到引力作用会下 沉，不同构象的分子沉降速度有很大 差异 超速离心：分离纯化核酸 测定核酸的沉降系数 相对分子量 Nhomakorabea6
二、核酸的沉降特性
密度梯度超离心 分离RNA常用蔗糖梯度，分离DNA 常用CsCl梯度
实验室纯化质粒DNA： 染料（溴乙锭）-CsCl密 度梯度超离心，得到的 DNA纯度较高，可用于 DNA重组，测序及限制 酶图谱等
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五、核酸的分离与纯化
琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)
琼脂糖浓度：2.5 － 0.1% 分离片段大小：5×104－5×108 D
琼脂糖凝胶用于分析DNA较好，分析 RNA时易降解，必须加入蛋白质变性剂 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 胶的浓度：24 －2.4 % 分离片段大小：3.3×102－1×106 D PAGE可分析小于1000bp的DNA和RNA
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三、核酸的变性、复性及杂交
4. DNA的熔解温度Tm(melting temperature) DNA变性的特点：爆发式
DNA的熔点Tm 通过加热使DNA的 双螺旋结构解旋50％时 的温度
DNA的Tm：82 – 95℃
S形曲线－DNA的变性曲线
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三、核酸的变性、复性及杂交
影响Tm值的因素 ⅰ）DNA的均一性 ⅱ）G-C 含量 ⅲ）介质的离子强度
氢键
碱基 解离状态
溶液pH
溶液的pH直接影响着双螺旋结构的稳定 核酸是两性电解质，在不同pH溶液中的 解离程度不同。两性解离导致兼性离子的形 成，所以核酸也有等电点
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四、核酸的酸碱性质
2、核酸的水解 酸水解 糖苷键和磷酸二酯键都可以被酸水解： 糖苷键，嘌呤碱基的糖苷键，脱氧核糖， 脱氧核糖与嘌呤碱基形成的糖苷键 最不稳定，易于得到无嘌呤酸 碱水解 RNA在碱性条件下会产生2’- 核苷 酸和3’- 核苷酸
