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核酸物理化学性质

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核酸理化性质讲义

核酸理化性质讲义

核算理化性质-讲义目录1.一般物理性质；2.核酸的紫外吸收；3.变性；4.复性；5.杂交；教学目的：了解核酸的一般物理性质及DNA序列的测定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、变性和复性及核酸的分离、提纯和定量测定。

教学重点：核酸的紫外吸收及变性和复性；教学难点：核酸的变性和复性1.一般物理性质1.1形态DNA —— 白色纤维状固体 RNA —— 白色粉末状固体1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；用乙醇可以沉淀核酸。

RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L NaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在碱性溶液中不稳定； DNA在碱性溶液中稳定。

显色反应：利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。

核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。

脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。

1.3粘度DNA溶液粘度极高 (因其分子直径小而长度大)RNA溶液粘度要小得多★核酸变性或降解后，粘度降低1.4两性解离概念：核酸为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，表现为两性离子状态，通常表现为酸性。

效果：由于磷酸基团的酸性很强，所以pI（等电点）较低，整个分子相当于多元酸。

应用：利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。

2. 紫外吸收性质2.1机理：嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。

2.2性质1：在260nm处有最大吸收峰。

对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。

A260/ A280值可以反映核酸的纯度。

性质2：纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.02.3.定义：增色效应(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。

第5章核酸的化学 第四节 核酸的性质

第5章核酸的化学 第四节 核酸的性质

食品生物化学
图5-15 RNA紫外吸收曲线
波长nm
食品生物化学
四、核酸的变性与复性
当核酸在某些理化因素（如有机溶剂、酸、碱、尿素、加 热及酰胺等）作用下，互补碱基对间的氢键断裂，双螺旋结构 松散，变成单链的过程称为变性(denaturation)。变性使核酸的 二级结构、三级结构改变，但核苷酸排列顺序不变。变性后的 核酸理化性质改变，生物学活性丧失。
核酸是相对分子质量很大的高分子化合物，高分子溶液比 普通溶液黏度要大得多，高分子形状的不对称性愈大，其黏度 也就愈大，不规则线团分子比球形分子的黏度大，线形分子的 黏度更大。由于DNA分子极为细长，因此即使是极稀的溶液也 有极大的黏度，RNA的黏度要小得多。
二、核酸的酸碱性质
核酸和蛋白质一样，也是两性电解质，在溶液中发生两性 电离。因磷酸基的酸性比碱基的碱性强，故其等电点偏于酸性。 利用核酸的两性解离能进行电泳，在中性或偏碱性溶液中，核 酸常带有负电荷，在外加电场力作用下，向阳极泳动。利用核 酸这一性质，可将相对分子质量不同的核酸分离。
DNA的变性是可逆的。变性DNA在适当条件下，变性的两 条互补链重新结合，恢复原来的双螺旋结构和性质，这个过程 称为复性(renaturation)。热变性的DNA经缓慢冷却（称退火处 理）即可复性。最适宜的复性温度比Tm值约低25℃，这个温度 又叫退火温度。
食品生物化学
图5-16 两种不同来源的DNA在260nm的吸收值与温度变化的关系
食品生物化学
DNA的解链过程发生于一个很窄的温度区内，DNA的变性 过程是爆发式的，有一个相变过程，把A260达到最高值的一半时 对应的温度称为该DNA的解链温度或融解温度，用Tm表示。 Tm值大小与DNA碱基组成有关，由于G-C之间的氢键联系要比 A-T之间的氢键联系强得多，故G＋C含量高的DNA其Tm值越高。 通过测定Tm值可知其G＋C碱基的含量。

核酸的理化性质

核酸的理化性质

精品资料
（二） 复性
2. 减色效应
四.变性与复性
当变性的DNA经复性(fù xìnɡ)以重新形成双螺旋结构 时，其溶液的A260值则减小，这种现象称为减色效应。
减色效应(xiàoyìng)常可用来衡量DNA复性的 程度。
精品资料
（二） 复性
四.变性与复性
3. 分子(fēnzǐ)杂 交
不同来源(láiyuán)的DNA分子放在一起热变性，然后慢慢 冷却，让其复性。这些异源DNA（RNA)之间有互补的序列或部分 互补的序列，则复性时会形成“杂交分子”。
(一) 变 性
变性后的DNA对260nm的紫外光吸收值比变性 前明显升高，这种现象称为(chēnɡ wé i)增色效应。
这是由于变性的DNA双螺旋解体，藏于螺旋内 部的碱基暴露出来。
增色效应常可用来衡量 DNA变性的程度。
精品资料
(一) 变 性
4. 热变性曲线(qūxiàn)(熔解 曲线(qūxiàn))
核酸的杂交广泛应用于分子遗传学中。
精品资料
精品资料
基因（gene)：DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列，其 编码产物是多肽链或RNA。 基因组(genome)：一种生物体的全部基因或染色体。 基因组学(genomics)：一门涵盖了对所有基因进行基因组作图、 核苷酸序列分析、基因定位和功能分析的科学。包括结构基因组 学(structural genomics) 和功能基因组学(fuctional genomics )。 生物信息学(bioinformatics)：将计算机科学和数学应用于生物大 分子信息的获取、加工(jiā gōng)、存储、分类、检索与分析，以 达到理解这些生物大分子信息的生物学意义的交叉学科。

核酸的理化性质

核酸的理化性质

线
尿嘧啶核苷酸
pK1 = 1.0 第一磷酸基
pK3 = 6.4 第二磷酸基
烯醇式羟基
21
pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离 子。
在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
完全水解 完全水解
嘧啶碱回收率高
6
二、碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感、因此RNA易被碱水解， 产生核苷酸。 在室温，0.3～1mol/L KOH，24h，就可将RNA完全水 解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA无2′-OH，因此对碱有一定抗性：
生理意义： DNA更稳定 ，是遗传信息的载体。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
Dase只作用于DNA 12
4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限制 性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
7
三、酶水解
（一）核酸酶的分类
①按底物专一性分类：
RNase（核糖核酸酶） DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶 ②按对底物作用方式分类： 核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类：
3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶
5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
磷酸基（含两个羟基）的解离

核酸的理化性质

核酸的理化性质

限制性内切酶
原核生物(及病毒)中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中 4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列， 并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末 端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。 山东落花生花落东山 帘卷晚晴天，天晴晚卷帘 Was it a cat I saw?

二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
2、核苷的解离
3、核苷酸的解离
结合及释放 质子的能力
第 1、碱基的解离 14 章 碱基：含氮碱基，杂环化合物（很多生物碱的结构） 核 1）、具有芳香环的结构特征，呈平面或近乎平面 酸 含有共轭双键体系，紫外区有吸收（260nm）。 的 物 2）、氮原子位于环上或取代氨基上 弱碱性来自于环上氮原子，pKa约9.5，倾向于接受H 理 取代氨基（或曰碱基环外的氨基）碱性很弱，生理 化 条件下不能被质子化。 学 性 质
核酸的物理化学性质
一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收性质 四、核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的水解
（一）酸水解 糖苷键比磷酸二酯键 更易被酸水解 嘌呤碱基的糖苷键比 嘧啶碱基的糖苷键对 酸更不稳定
NH 2
酯键
O
N N O
N 9 N
5' HO P O CH2 O
-
糖苷
1' H H 2' OH
H
H OH
腺苷酸
（二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱 水解，产生核苷酸。 由于RNA的核糖上有2’OH基，在碱作用下形成 磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随 即水解产生，产生 2’,3’-环磷酸酯，再水 解成2’-核苷酸及3’-核 苷酸

核酸的物理化学性质

核酸的物理化学性质

第15章、核酸的物理化学性质（上册P502）本章重点：1、核酸的水解，2、核酸的紫外吸收，3、核酸的变性和复性本章的主要内容：（一）核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。

（1）酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。

（2）碱水解：磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过程见P502。

（3）酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。

1.核酸酶的分类：按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。

按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。

2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。

3.限制性内切酶：为DNase。

剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。

在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。

限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源DNA。

断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。

限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。

（二）核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。

由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。

（三）核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。

（1）可用于测样品纯度（测吸光度A）：A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。

第15章-核酸的物理化学性质和研究方法

第15章-核酸的物理化学性质和研究方法

4.密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象的 DNA
超螺旋DNA或
（五） 核酸的凝胶电泳 p254
核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。
通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。
1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）
总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。
（3）Western blotting
将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝 酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标 记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种 技术叫做Western蛋白质杂交技术。
原理：抗原和抗体结合
测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。
一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700—7 800。 单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸的 ε(P)值要高。
核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为增色 效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的π电子云 发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收）
2.密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系
ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10
但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低， 低于理论值。
3.密度梯度超速离心研究核酸的构象
RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大
碱 基
（一）核酸的酸水解
水解特点：
戊
糖
1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解

核酸的性质

核酸的性质

DNA的核苷酸序列测定
DNA的测序策略
DNA片断的序列测定
英国Sanger ， 1975年加减法，1977年末端 终止法，目前广泛用于DNA的自动测序 美国Maxam和Gilbert ， 1977年化学断裂法 基本原理：把DNA变成在不同碱基的核苷酸处 打断的四套末端标记的DNA片断，当相应于四 个不同碱基产生的四套DNA片断并排进行电泳 分离时，产生一个可以直接读出DNA顺序的区 带。
模板DNA的变性：双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性 成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的 互补序列配对结合（退火温度与Tm有关，温度太低非特 异扩增增加，温度过高引物和模板不易结合） 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半 保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板
真核生物mRNA的分离：亲和层析
真核生物的mRNA有polyA的尾巴，能被oligo-dT柱 子吸附而和其他物质分离开来
真核生物ｍＲＮＡ的分离
核酸纯度鉴定与含量测定
根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度 （若样品中含有杂蛋白或苯酚，则 A260/A280比值明显降低）
纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0
核酸的物理化学性质
核酸的水解 核酸的磷酸二酯键和糖苷键可 以被水解

室温条件下，DNA在碱中变性， 但不水解，RNA水解，水解产物为 2’-和3’-核苷酸的混合物。

核酸的物理化学性质和常用的研究方法

核酸的物理化学性质和常用的研究方法
3） 引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列 4） 引物之间不应有大于4bp以上的互 补序列或同源序列 5） 引物中碱基的分布要尽可能均匀， G + C含量接近50％
25
七、聚合酶链反应（PCR）
2、优化反应条件 包括模板、引物、 dNTP、DNA聚 合酶和Mg2＋，PCR中常用的聚合酶是 Taq DNA聚合酶 3、 选择热循环温度 PCR 过程的温度控制十分关键。 热循环温度：变性温度，退火温度（低 于引物Tm值的2-3℃），延伸温度
A：光吸收值 C：磷的摩尔浓度 L：比色杯内径 W：每升溶液中磷的重量（g）
4
一、核酸的紫外吸收
DNA的ε(P)：6600 RNA的ε(P)：7700-7800
核酸的ε(P)比核苷酸单体低 单链多核苷酸的ε(P)比双螺 旋多核苷酸的ε(P)要高 增色效应：核酸变性时， ε(P)增加 减色效应：当核酸复性时， ε(P)降低
第十九章
核酸的物理化学性质 和常用的研究方法
1
核酸的物理化学性质
天然DNA分子细丝状的双螺旋结构 赋予DNA一系列显著的物化特性： 极大的粘度； 易于断裂； 易形成纤维状物质； 在稀盐溶液中热变性； 熔点高 RNA分子没有如此明显的物化特性
2
一、核酸的紫外吸收
1、核酸具有紫外吸收 吸收范围：240-290 nm λmax = 260nm （定量测定） 2、根据紫外吸收判断样品纯度 不纯的样品
29
九、DNA的限制酶图谱
细菌内有二种不同功能的酶(Arber等) ： 限制性内切酶：识别并水解DNA的某特 定碱基序列 修饰酶(甲基化酶)：识别限制酶识别的碱 基顺序并将其甲基化 被甲基化了的DNA不会被限制酶降解， 所以细菌自身的DNA不会被自身酶降解。 而当异源DNA侵入细胞时，就会被限制酶 降解

(完整版)核酸的理化性质.doc

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第 15 章、核酸的物理化学性质（上册 P502）本章重点： 1、核酸的水解， 2、核酸的紫外吸收， 3、核酸的变性和复性本章的主要内容：（一）核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。

（1）酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。

（2）碱水解：磷酸酯键易水解， RNA 比 DNA 易水解，因为 RNA 核糖上有 2‘ - OH ，水解过程见P502。

（3）酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。

1.核酸酶的分类：按底物专一性分为 RNase（核糖核酸酶）和 DNase（脱氧核糖核酸酶）。

按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。

2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（ EC 2.7.7.16 ），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（ Py）‘- 3 - 磷酸与其他核苷酸之间的连键。

3.限制性内切酶：为 DNase。

剪裁 DNA 的工具，可用于核酸测序和基因工程。

在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。

限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源 DNA 。

断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。

限制性内切酶命名：如 E. coR Ⅰ，第 1 个字母 E( 大写 ) ，为大肠杆菌 (E.coli)属名的第一个字母，第2、 3 两个字母co （小写）为种名头两个字母，第 4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。

（二）核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。

由于 DNA 酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。

（三）核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在 260nm 附近（蛋白质最大吸收值280nm）。

核酸检测物理知识点总结

核酸检测物理知识点总结

核酸检测物理知识点总结一、核酸的结构与性质1.1 核酸的化学结构核酸是一种由核苷酸经过磷酸二脂酸酯键连接形成的生物大分子，包括DNA和RNA两种类型。

DNA由脱氧核糖核苷酸组成，RNA由核糖核苷酸组成。

核苷酸由核苷和磷酸二脂酸组成，核苷包括一个含氮碱基和一个糖分子，磷酸二脂酸作为链的连接部分。

1.2 核酸的物理性质核酸具有许多特殊的物理性质，如双螺旋结构、碱基配对、DNA超螺旋等。

其中双螺旋结构是DNA的典型结构，由两条螺旋形成，而碱基配对是通过氢键将两条链连接在一起，碱基的配对规律是腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间形成两个氢键，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间形成三个氢键。

此外，DNA还具有超螺旋结构，这种结构形式使得DNA在细胞分裂时更容易分离。

1.3 核酸的光学性质核酸具有一定的光学性质，如吸收光谱、荧光光谱等。

DNA和RNA在紫外光下有显著的吸收，其中DNA在260nm处有最大吸收峰，而RNA在260nm处有一个稍微红移的吸收峰。

此外，核酸还具有荧光发射的性质，一些荧光染料可以与核酸结合产生荧光信号，用于核酸的检测和定量分析。

二、核酸检测的原理与技术2.1 核酸检测的原理核酸检测的原理是通过特定的技术手段来识别和检测样品中的核酸序列，常用的技术包括PCR（聚合酶链式反应）、分子杂交、核酸电泳、原位杂交等。

PCR是最常用的核酸扩增技术，通过模拟细胞内DNA复制的过程来扩增目标DNA序列，从而实现对目标基因的检测和分析。

2.2 核酸检测的技术手段核酸检测的技术手段包括一系列的实验方法和设备，如核酸提取、PCR扩增、凝胶电泳、原位杂交、微阵列技术等。

其中核酸提取是核酸检测的首要环节，其目的是从样品中提取出目标DNA或RNA序列，为后续的PCR扩增和检测做准备；PCR扩增是一种快速、高效、特异性强的核酸扩增技术，可将目标核酸的复制数量扩大上百万倍，从而实现对微量核酸的检测和分析。

2.3 核酸检测的应用核酸检测技术在临床医学、疾病预防和控制、食品安全监测等领域有着广泛的应用，如临床诊断中的传染病检测、肿瘤基因检测、遗传病筛查等；疾病预防和控制中的病毒核酸监测、病原微生物检测、环境污染监测等；食品安全监测中的食源性疾病的检测、转基因食品的检测等。

核酸性质

核酸性质

核酸的凝胶电泳
核酸的序列测定 DNA聚合酶链反应 DNA的化学合成
第十五章 核酸的研究方法
一 核酸的分离、提纯和定量测定
核酸制备
总的要求：防止核酸的降解和变性，要尽量保
持其在生物体内天然状态
注意的事项：条件温和，防止过酸、过碱、避
免剧烈搅拌，防止核酸酶作用
P513
第十五章 核酸的研究方法
（一）DNA的分离

Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（三）、核酸的杂交
2. 常见杂交的类型


（1）Southern blotting （2）Northern blotting （3）Western blotting
（1）. Southern印迹杂交

将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的 滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂 交作用检测这些被转移的DNA片段
经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44


(3)介质中的离子强度 一般在较高的离子强 度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在 一个较小的温度范围之内。
P509
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（二）、复性 (renaturation)

变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺 旋结构，这过程称复性 1. DNA复性的特点：
一、 核酸的水解
二、核酸的酸碱性质
三、核酸的紫外吸收
四、核酸的变性、复性及分子杂交 五、核酸的沉降特性
502
Chapter14
核酸的物理化学性质

生物化学-生化知识点_核酸的物理化学性质

生物化学-生化知识点_核酸的物理化学性质

7-3 核酸的物理化学性质上册P502一一一核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。

一1一酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。

一2一碱水解：磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过程见P502。

一3一酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。

1.核酸酶的分类：按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。

按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。

2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。

3.限制性内切酶：为DNase。

剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。

在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。

限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源DNA。

断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。

限制性内切酶命名：如E. coRⅠ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。

一一一核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。

由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。

一一一核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。

一1一可用于测样品纯度（测吸光度A）：A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。

对于纯样品，从260nm的A值即可算出含量。

13 核酸的物理化学性质和研究方法

13 核酸的物理化学性质和研究方法

按底物专一性可分为DNA水解酶（DNases）和RNA水解 酶（RNases）。 根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。
举例1. 蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶
举例2. 胰核糖核酸酶A（RNase A）
举例3. 脱氧核糖核苷酸酶（DNases）
5’ 3’
3’ 5’
a型
DNase I
2.酶水解
CH3
H
N H O N H
O
C(胞嘧啶)解离为N3-H（pK1=4.6); U和T环上无NH2， N3-H解离分别为（pK1=9.5； pK1=9.9)
二、核酸的酸碱性质
1. 碱基的解离 鸟嘌呤解离为： N7-H（pK1=3.2); N1-H （pK2=9.6); N9-H （pK3=12.4) 腺嘌呤解离为： N1-H （pK1=4.15); N9-H （pK2=9.8)
限制性内切酶和限制性图谱
目前所用的限制性内切酶都是来自细菌，可分为两类， 类型I：是一种多功能酶，既能降解DNA又能修饰DNA， 具有ATP酶的功能。 类型 II ：是一种较为简单的酶，这种酶不表现出修 饰（甲基化）的活性，能识别DNA分子上特殊的序列， 如果该序列没有被修饰，即可切断DNA分子。一般识 别的是 4-6bp 的回文结构。切断 DNA 分子可产生粘性 末端和平头末端。
0.2 0.1
0 220 240 260 280 300 320 340
Wavelength (nm)
分光光度法测定核酸的浓度和纯度
1. 核酸浓度测定
OD260 = 1.0 相当于
50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
A260 260cL A Mass(mg ) 260 M n V r 260
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2、RNase
Py Pu Py Py Py Pu Py Py
2H2O
P P P P
+
P P
P
P
+
P P
（1）牛胰核糖核酸酶（RNase Ⅰ）
作用：嘧啶核苷3’－磷酸与其它核苷酸连键 专一性极高的内切酶 产物： 3’嘧啶核苷酸/其结尾的寡核苷酸
（2）核糖核酸酶T1 （RNase T1）
作用：3’－鸟苷酸与相邻核苷酸5’－OH连键 产物：3’－鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸
3.核苷酸的解离
•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
O R O P OH
pK 0.7 1.6
' 1
O O P OH
N
OH
R
O
-
pK 5.9 6.5
' 2
O O P O
-
R
O
-
H
CH 2 O
H
CH 2 O
N
-
OH pK1' 1.5
OH
-
OH
-
O O P O
O O P O O
Na+激活；Mg2+抑制 ——3’－磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均 长度为6核苷酸。
③链球菌脱氧核糖核苷酸酶：
内切酶，作用于DNA， Mg2+激活 产物为5’－磷酸为末端的碎片，长度不一。
④限制性内切酶(细菌)
主要降解外源DNA 具严格的碱基序列专一性 是基因工程最重要的工具酶。
例如EcoR I ，需Mg离子，不需ATP，专一 性强，能识别DNA链上6个碱基组成的回文 序列，交错切割，形成粘性末端产物。
判断DNA是否变性
G
A
C
U
G
A
G
A
C
U
G
A
2H2O
P P P P P P P P
+
P OH P P P
+
P OH P
（3）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ）
• 作用位点为Ap残基
• 可将tRNA完全降解为3’－腺苷酸结尾 的寡核苷酸
3、DNase
①DNaseⅠ：牛胰脱氧核糖核酸酶 Mg2+激活、柠檬酸盐抑制 切断双链或单链DNA ——以5’－磷酸为末端的寡聚核苷酸 ② DNase Ⅱ：牛脾脱氧核糖核酸酶
2. 纯DNA或RNA的紫外分光定量
OD260=1.0相当于
• 50μg/ml双链DNA
• 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
有些核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示， 摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
30.98 A P）＝ （ WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
天然DNA的ε(P）一般为－6600 RNA的ε(P）一般为7700－7800
核酸的ε(P）值较所含核苷酸单体的ε(P）要低40%～45%； 单链多核苷酸的ε(P）值比双螺旋结构多核苷酸ε(P）值要 高。 所以在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大约25%， 此现象称为增色效应。 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
H
N
-
H
O N H O N H
O
N H
尿嘧啶及胸腺嘧啶中
O O O CH3 NH O
NH
pK1' 9.5 NH
N H O N H O
pK1' 9.9 NH
O N H
CH3
O
N H
腺嘌呤中，质子结合于N1上
NH2
+
NH2 N
NH2 N
' pK 2 9.8
HN
pK1' 4.15 N
H
N
H+ N
N
N
N
NH O
NH
H
O N
N
N
-
HN
pK1' 3.2
H
H2N
HN
' pK 2 9.6
H2N
N
NH
N
NH
H
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
-
O H+
H2N
N
-
N
H2N
N
NH
N
N
-
2、核苷的解离
•戊糖可增强碱基的酸性解离 •核糖中的羟基也可发生解离
‥GAATTC ‥ ‥CTTAAG ‥ ‥G ‥CTTAA AATTC‥ G‥
EcoRⅠ命名原则 E：大肠杆菌E.coli属名 co：种名的头两个字母
R：大肠杆菌的菌株
Ⅰ：该细菌中已分离出的这类酶的编号
限制性内切酶通常与甲基化酶成对存在： 具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列。 甲基供体：S－腺苷甲硫氨酸 甲基受体：DNA上的A与C ——甲基化使细菌自身的DNA带上标记, 限制性内切酶专用于降解外来入侵的异种DNA
③按照作用的化学键 磷酸二酯酶（phosphodiesterase）
断3′-OH形成的酯键 断5′-OH形成的酯键 5′-磷酸核苷 3′-磷酸核苷
磷酸单酯酶（phosphomonoesterase）
——切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基
④其它：对底物二级结构的专一性 双链酶：作用于双链核酸 单链酶：作用于单链核酸
（二）碱水解
RNA磷酸酯键被水解——生成2’/3’ -核苷酸
DNA则不受影响
∵脱氧核糖无2’－OH， ∴不能形成碱水解中间产物
DNA在1mol/LNaOH中加热至100℃4h，可得 到小分子的寡聚脱氧核苷酸。
（三）酶水解——磷酸二酯键
1、酶分类
①根据底物分为： DNase、RNase ②根据作用方式： •核酸外切酶 从一端（3′/5′）逐个水解 •核酸内切酶 从中间开始在某个位点切断
4、N－糖苷酶
水解糖苷键
非特异性的糖苷酶
碱基特异N－糖苷酶
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
具有芳香环结构特点 • 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 • 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 ______主要是环内氨基的贡献
二
胞嘧啶中
NH2
+
NH2
NH2
' pK 2 12.5
HN
pK1' 4.6 N
一、核酸的水解
酸、碱、酶水解
• 作用于磷酸二酯键和糖苷键 • DNA/RNA对酸/碱的耐受程度有差别
（一）酸水解
糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解； 嘌呤碱比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定； 对酸最不稳定的：嘌呤与脱氧核糖间糖苷键
DNA: pH2.8、100℃加热1h，或pH1.6，37 ℃对水透析 可除去嘌呤碱 形成无嘌呤酸（apurinic acid，APA）
H

CH 2 O
N
CH 2 O
N
OH
OH
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
可用紫外分光光度计 加以定量和定性。
• OD260的应用： 1.判断核酸样品的纯度
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低