核酸物理化学性质优秀课件 (2)
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生物化学 第2章Ⅱ 核酸(共86张PPT)
内呈正比
5、电泳缓冲液
DNA的凝胶电泳检测
(ethidiumbromide， 简称EB)是一种核酸染料，可以插入到DNA
或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的
紫外光照射下放射出橘红色的荧光，可用来显现 凝胶中的核酸分子。
在凝胶电泳中，溴化乙锭染料可对核酸分子 染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地检测 出凝胶介质中DNA谱带。
五、变性、复性与杂交
（一）、DNA的变性
1、概念 2、变性因素
3、变性的指标
1、概念
是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双螺旋 解开，变成无规则线团的现象。核酸变 性其分子中的共价键并没有破坏，分子 量也不改变，核酸的变性（
denaturation ）
2、DNA的变性的因素
温度升高；
酸碱度改变、 pH（>11.3或<5.0）；
1、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦
系数成反比的 Maxam和Gilbert 于1977年发明
Primer1（10uM）
2、琼脂糖的浓度：迁移率与胶浓度成反比 而聚丙烯酰胺凝胶制胶时不能将染料加入，会影响聚合。
第五节 核酸的研究方法 据此特性可以定性和定量检测核酸。
在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片；
RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变 性行为所引起的性质变化没有DNA那样 明显。 天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸
收(260 nm)值增加25－40%.而RNA变性 后，约增加1.1%。
4. DNA变性后的表现
A260值增加
粘度下降
浮力密度增大
分子量不变
（二）、DNA的复性
1、概念：
变性DNA在适当的条件下，两条彼此分 开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构 ，这一过程称为复性；
核酸化学(汇总).ppt
123
精选文档
32
〔二〕核苷酸〔nucleotide, Nt〕
1．核苷酸的构造
〔1〕〔核糖〕核苷酸〔ribonucleotide〕：
123
精选文档
33
2’，3’，5’一核糖核苷酸
(2´-AMP) 123
(3´-AMP) 精选文档
(5´-AMP) 34
123
精选文档
35
〔2〕脱氧〔核糖〕核苷酸〔deoxyribonucleotide〕： 3’，5’一脱氧核糖核苷酸
〔3〕磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键 生理pH条件下DNA带有大量的负电荷，吸引着各种阳离子，组蛋白、 Na+、K+ 、Mg2+ 等，形成了离子键，消除了自身因带负电荷而产生 的斥力，增加了DNA的稳定性。
① 不均一核RNA〔heterogeneous nuclear RNA,HnRNA〕 ② 小分子核RNA〔small nuclear RNA, sn RNA〕 ③ 小分子核仁RNA〔small nucleolar RNA, sno RNA〕 ④ 染色体RNA〔chromosomal RNA, ch RNA〕
123
精选文档
4
脱氧核糖核酸〔DNA〕
DNA分子含有生物 物种的所有遗传信 息，分子量一般都 很大。
DNA为双链分子， 其中大多数是链状 构造大分子，也有 少局部呈环状构造。
123
精选文档
5
DNA
双链线状
真核细胞染色体DNA 噬菌体T2，T5，T7，λ，P22
双链环状
E-Coli染色体DNA 线粒体DNA 叶绿体DNA 多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA 噬菌体λ和φX174的复制型
核酸的理化性质PPT
由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低 ，整个分子相当于多元酸。
利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶
液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸
。
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5
三. 紫外吸收性质
嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸 收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯 的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核 酸含量。
核酸的理化性质
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1
一.一般的物理性质
1. 形 态
➢ DNA —— 白色纤维状固体 ➢ RNA —— 白色粉末状固体
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2
一.一般的物理性质
2. 溶 解性
➢ 微溶于水
➢ 不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂
➢ RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L的NaCl溶液
这是由于变性的DNA双螺旋解体，藏于螺旋内 部的碱基暴露出来。
增色效应常可用来衡量 DNA变性的程度。
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4. 热变性曲线(熔解曲线)
(一) 变 性
在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。
变性百分率 A260
不 同 DNA 的 熔 解
100
曲线不同，但很
类似。都是 —
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0
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6
(一) 变 性
1. 变性的概念
四.变性与复性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空 间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
A260值升高 粘度下降
核酸的重要理化性质ppt课件
4、核酸的复性
变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单 链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为 复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将 得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程 的条件有关。
将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可 能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以 复 性 ， 这 一 过 程 也 叫 退 火 （ annealing)。 分 子 量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外， DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。
Tm与介质中离子强度有关：DNA的保存应在含盐的缓冲液中
A260 0.02
0.1 1.0 mol/LKCl
温度/0C
DNA变性（加热或极端 pH）
当DNA的稀盐 溶液加热到80100℃时，双螺 旋结构即发生解 体，两条链彼此 分开，形成无规 线团。
DNA变性后， 它的一系列性质 也随之发生变化， 如紫外吸收 (260 nm)值升 高, 粘度降低等。
3.DNA的热变性和解链温度（Tm）
用加热的方法使DNA变性叫做热变性 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度
区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到 50%时，即增色效应达到一半时的温度称为 DNA的解链温度（melting temperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA 的熔点。
一般DNA的Tm值在70-85C之间
RNA的T m值 tRNA的T m值
G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中
G、 C含量，可通过经验公式计算：
（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44
Tm大小可反映出DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在 一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽 的温度范围内。
化工专业生物化学课件—核酸的物理化学性质
– 只有纯的样品才能 用分光）
• 核苷酸中磷含量测定
• 摩尔磷吸光系数[ε(P)]的变化可 以判断核酸是否发生变性
– 增色效应： 核酸变性时，得到的单 链核酸的[ε(P)]要比双链核酸高出 25%，称增色效应
– 减色效应：复性后， [ε(P)]发生降 低后的现象，称减色效应
• 03 限制性内切酶
– 主要降解外源DNA
– 大肠杆菌来源的EcoR I
– 限制性内切酶与甲基化酶（A/C）成对出现
2.核酸的酸碱性质—碱基解离（P504）
• 碱基的酸碱性质：嘧啶和嘌呤碱杂环上的氮原子（N）及 其取代基具有结合与释放质子的能力
– 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，解离常数一般测不出
• 核苷的解离
核苷酸的解离曲线（P507）
• 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，基本测不出其含氮杂环的 解离曲线，因此没有碱性离子状态，也无pI
3.核酸的紫外吸收-1（P507）
• 原因：
– 嘌呤和嘧啶碱具有 共轭双键，在紫外 波段具有特征吸收 （260nm）
• 作用
– DNA或RNA定量测 定
– DNA（1.8）或 RNA（2.0）纯度测 定（A260/A280）
x(G+C)=(Tm-69.3)X2.44
• 环境的离子强度
– 较低离子浓度环境中，Tm低而宽 – 较高离子浓度环境中，Tm高而窄
5.DNA的复性（P509-10）
• 复性
– 变性的两条DNA单 链在一定条件下重新 形成双链的过程
• 退火
– 热变性的单链DNA 在缓慢冷却的过程中 复性的现象
– DNA片段越大，复 性越慢
• 02 核糖核酸酶T1
– 专一性更强：只水解鸟嘌呤核苷酸（G）3端的磷酸形成的磷酯键 – 耐热、耐酸
• 核苷酸中磷含量测定
• 摩尔磷吸光系数[ε(P)]的变化可 以判断核酸是否发生变性
– 增色效应： 核酸变性时，得到的单 链核酸的[ε(P)]要比双链核酸高出 25%，称增色效应
– 减色效应：复性后， [ε(P)]发生降 低后的现象，称减色效应
• 03 限制性内切酶
– 主要降解外源DNA
– 大肠杆菌来源的EcoR I
– 限制性内切酶与甲基化酶（A/C）成对出现
2.核酸的酸碱性质—碱基解离（P504）
• 碱基的酸碱性质：嘧啶和嘌呤碱杂环上的氮原子（N）及 其取代基具有结合与释放质子的能力
– 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，解离常数一般测不出
• 核苷的解离
核苷酸的解离曲线（P507）
• 尿嘧啶核苷酸碱基的碱性极弱，基本测不出其含氮杂环的 解离曲线，因此没有碱性离子状态，也无pI
3.核酸的紫外吸收-1（P507）
• 原因：
– 嘌呤和嘧啶碱具有 共轭双键，在紫外 波段具有特征吸收 （260nm）
• 作用
– DNA或RNA定量测 定
– DNA（1.8）或 RNA（2.0）纯度测 定（A260/A280）
x(G+C)=(Tm-69.3)X2.44
• 环境的离子强度
– 较低离子浓度环境中，Tm低而宽 – 较高离子浓度环境中，Tm高而窄
5.DNA的复性（P509-10）
• 复性
– 变性的两条DNA单 链在一定条件下重新 形成双链的过程
• 退火
– 热变性的单链DNA 在缓慢冷却的过程中 复性的现象
– DNA片段越大，复 性越慢
• 02 核糖核酸酶T1
– 专一性更强：只水解鸟嘌呤核苷酸（G）3端的磷酸形成的磷酯键 – 耐热、耐酸
第6章核酸的化学ppt课件
❖ 主要核苷酸： 生物体中游离的核苷酸多为5′-核苷酸。
常见的核苷酸
核糖核酸(在RNA中)
脱氧核糖核酸（在DNA中）
全称
简称 代号
全称
简称 代号
腺嘌呤核苷酸 腺苷酸 AMP 腺嘌呤脱氧核苷酸 脱氧腺苷酸 dAMP 鸟嘌呤核苷酸 鸟苷酸 GMP 鸟嘌呤脱氧核苷酸 脱氧鸟苷酸 dGMP 胞嘧啶核苷酸 胞苷酸 CMP 胞嘧啶脱氧核苷酸 脱氧胞苷酸 dCMP 尿嘧啶核苷酸 尿苷酸 UMP 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 脱氧胸苷酸 dTMP
尿嘧啶 尿嘧啶核苷 尿苷 U
－
－
－
胸腺嘧啶
－
－ － 胸腺嘧啶脱氧核苷 脱氧胸苷 dT
2.核苷酸〔nucleotide〕
❖ 核苷酸：是核苷中戊糖环上的羟基与磷酸脱水生成的核苷磷 酸酯。
❖ 类型：核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，它们是RNA和DNA 的根本组成单位。
❖ 核苷酸：核苷+磷酸，戊糖+碱基+磷酸
5´ p
p
p
p
OH 3´
5´ 3´
线条式
5´ ACTGCATAGCTCGA 3´
字母式
构造式
〔二〕DNA的一级构造
❖ 概念：是指DNA分子中脱氧核苷酸的陈列顺序。由于不同 的脱氧核苷酸只是碱基的不同，所以DNA的一级构造也是 指脱氧核苷酸中碱基的陈列顺序。
❖ DNA碱基组成所遵照的规律：〔查加夫规律〕 ❖ A.具有生物物种的特异性。即不同物种的DNA有其特有的
呤碱的第9位N原子或嘧啶碱的第1位N原子经过N-糖苷键相 连，这种糖与碱基之间的连键是C-N糖苷键。
1.核苷
NH2
OH
N
NN
N
NH2 N
常见的核苷酸
核糖核酸(在RNA中)
脱氧核糖核酸（在DNA中）
全称
简称 代号
全称
简称 代号
腺嘌呤核苷酸 腺苷酸 AMP 腺嘌呤脱氧核苷酸 脱氧腺苷酸 dAMP 鸟嘌呤核苷酸 鸟苷酸 GMP 鸟嘌呤脱氧核苷酸 脱氧鸟苷酸 dGMP 胞嘧啶核苷酸 胞苷酸 CMP 胞嘧啶脱氧核苷酸 脱氧胞苷酸 dCMP 尿嘧啶核苷酸 尿苷酸 UMP 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 脱氧胸苷酸 dTMP
尿嘧啶 尿嘧啶核苷 尿苷 U
－
－
－
胸腺嘧啶
－
－ － 胸腺嘧啶脱氧核苷 脱氧胸苷 dT
2.核苷酸〔nucleotide〕
❖ 核苷酸：是核苷中戊糖环上的羟基与磷酸脱水生成的核苷磷 酸酯。
❖ 类型：核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，它们是RNA和DNA 的根本组成单位。
❖ 核苷酸：核苷+磷酸，戊糖+碱基+磷酸
5´ p
p
p
p
OH 3´
5´ 3´
线条式
5´ ACTGCATAGCTCGA 3´
字母式
构造式
〔二〕DNA的一级构造
❖ 概念：是指DNA分子中脱氧核苷酸的陈列顺序。由于不同 的脱氧核苷酸只是碱基的不同，所以DNA的一级构造也是 指脱氧核苷酸中碱基的陈列顺序。
❖ DNA碱基组成所遵照的规律：〔查加夫规律〕 ❖ A.具有生物物种的特异性。即不同物种的DNA有其特有的
呤碱的第9位N原子或嘧啶碱的第1位N原子经过N-糖苷键相 连，这种糖与碱基之间的连键是C-N糖苷键。
1.核苷
NH2
OH
N
NN
N
NH2 N
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9.6
H
NH
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
O
N-
H N
+
p
K
' 3
12.4
N-
N
H2N
N
H
NH
H2N
N
N-
2、核苷的解离
•戊糖可增强碱基的酸性解离 •核糖中的羟基也可发生解离
3.核苷酸的解离
•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
O p K 1 ' 0 .7 1 .6
ROP OH
R
O
OP O - p K 2 ' 5 .9 6 .5 R
产物： 3’嘧啶核苷酸/其结尾的寡核苷酸
（2）核糖核酸酶T1 （RNase T1）
作用：3’－鸟苷酸与相邻核苷酸5’－OH连键 产物：3’－鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸
G
A
C
U
G
A
G
A
C
U
G
A
2H2O +
+
PP
P
P
P
P
P
P
P OH P
P
P
P OH P
（3）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ）
• 作用位点为Ap残基 • 可将tRNA完全降解为3’－腺苷酸结尾
核酸物理化学性质
扬州大学生物科学与技术学院
一、核酸的水解
酸、碱、酶水解 • 作用于磷酸二酯键和糖苷键 • DNA/RNA对酸/碱的耐受程度有差别
（一）酸水解
糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解； 嘌呤碱比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定； 对酸最不稳定的：嘌呤与脱氧核糖间糖苷键
DNA: pH2.8、100℃加热1h，或pH1.6，37 ℃对水透析 可除去嘌呤碱
①根据底物分为： DNase、RNase ②根据作用方式：
• 核酸外切酶 从一端（3′/5′）逐个水解 • 核酸内切酶 从中间开始在某个位点切断
③按照作用的化学键
磷酸二酯酶（phosphodiesterase）
断3′-OH形成的酯键 5′-磷酸核苷 断5′-OH形成的酯键 3′-磷酸核苷
磷酸单酯酶（phosphomonoesterase）
形成无嘌呤酸（apurinic acid，APA）
（二）碱水解
RNA磷酸酯键被水解——生成2’/3’ -核苷酸 DNA则不受影响
∵脱氧核糖无2’－OH， ∴不能形成碱水解中间产物
DNA在1mol/LNaOH中加热至100℃4h，可得 到小分子的寡聚脱氧核苷酸。
（三）酶水解——磷酸二酯键
1、酶分类
有些核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示， 摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
（P）＝8A
WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
天然DNA的ε(P）一般为－6600 RNA的ε(P）一般为7700－7800
核酸的ε(P）值较所含核苷酸单体的ε(P）要低40%～45%； 单链多核苷酸的ε(P）值比双螺旋结构多核苷酸ε(P）值要高。
限制性内切酶通常与甲基化酶成对存在： 具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列。
甲基供体：S－腺苷甲硫氨酸 甲基受体：DNA上的A与C ——甲基化使细菌自身的DNA带上标记, 限制性内切酶专用于降解外来入侵的异种
DNA
4、N－糖苷酶
水解糖苷键
非特异性的糖苷酶 碱基特异N－糖苷酶
二、核酸的酸碱性质
所以在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大约25%， 此现象称为增色效应。 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
判断DNA是否变性
四、核酸的变性、复性与杂交
(一) 核酸的变性（denaturation） 1、DNA的变性：
在某些理化因素作用下，DNA双链解 开成两条单链的过程。
的寡核苷酸
3、DNase
①DNaseⅠ：牛胰脱氧核糖核酸酶
Mg2+激活、柠檬酸盐抑制 切断双链或单链DNA ——以5’－磷酸为末端的寡聚核苷酸 ② DNase Ⅱ：牛脾脱氧核糖核酸酶
Na+激活；Mg2+抑制 ——3’－磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均 长度为6核苷酸。
③链球菌脱氧核糖核苷酸酶：
内切酶，作用于DNA， Mg2+激活 产物为5’－磷酸为末端的碎片，长度不一。
——切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基
④其它：对底物二级结构的专一性
双链酶：作用于双链核酸 单链酶：作用于单链核酸
2、RNase
Py Pu Py Py
Py
Pu Py
Py
2H2O
+
+
PP
P
P
P
PP
P
P
P
（1）牛胰核糖核酸酶（RNase Ⅰ）
作用：嘧啶核苷3’－磷酸与其它核苷酸连键 专一性极高的内切酶
④限制性内切酶(细菌)
主要降解外源DNA 具严格的碱基序列专一性 是基因工程最重要的工具酶。
例如EcoR I ，需Mg离子，不需ATP，专一 性强，能识别DNA链上6个碱基组成的回文 序列，交错切割，形成粘性末端产物。
‥GAATTC ‥ ‥CTTAAG ‥
‥G ‥CTTAA
AATTC‥ G‥
EcoRⅠ命名原则 E：大肠杆菌E.coli属名 co：种名的头两个字母 R：大肠杆菌的菌株 Ⅰ：该细菌中已分离出的这类酶的编号
可用紫外分光光度计 加以定量和定性。
• OD260的应用： 1.判断核酸样品的纯度
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低
2. 纯DNA或RNA的紫外分光定量
OD260=1.0相当于
• 50μg/ml双链DNA • 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
1、碱基的解离
具有芳香环结构特点 • 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 • 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性
______主要是环内氨基的贡献
二 胞嘧啶中
NH2 HN+
ON H
NH2
NH2
pK1' 4.6 N
H
ON H
pK2' 12.5 N
H
O- N H
尿嘧啶及胸腺嘧啶中
O
O
O
NH pK1' 9.5N-
ON H
H
ON H
NH
ON H
O
CH3
pK1' 9.9N-
H
ON H
CH3
腺嘌呤中，质子结合于N1上
N H 2
N H 2
N H 2
H N +
N pK 1 ' 4.15N
N pK2 ' 9.8 N
N
H
N
N HO
H N
+
HN
H2N
N
NH
N
N H H
O
p
K
' 1
3.2
HN
H
H2N
N
N
N -
N
p
K
' 2
O OP O -
H
OH
H
OH
O -
CH 2 O
N
-
OH
O
O P OH
O
CH 2 O
N
pK
' 1
1 .5
H
CH 2 O
N
-
OH
O
O P O-
O
CH 2 O
N
OH
OH
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右