污水处理厂污泥细菌总数和粪大肠菌群的检测

医院污水监测方法本文介绍了医院污水监测的方法，包括细菌总数及粪大肠菌群的测定以及污水中沙门菌、志贺菌的检验步骤。

细菌总数及粪大肠菌群的测定采样时间为消毒后1小时，排放前进行采样。

采样方法包括灭菌、消毒、排水和采样。

采样时应注意加氯处理的污水需要中和余氯，以终止余氯的杀菌作用。

采样量应为采样瓶容量的80%左右，以便在检验时可以充分摇动水样。

水样从采集到检验一般不超过2小时，如需要保存，也应不超过4小时。

细菌总数的测定方法是将1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养48小时后，计算所生长的细菌菌落数。

操作方法包括无菌操作、稀释液制备、接种平皿等步骤。

粪大肠菌群的检验方法采用发酵法，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验。

结果报告应根据阳性管（瓶）数查表1或表2，报告每升水样中的粪大肠菌群数。

污水中沙门菌、志贺菌检验步骤本文未提供相关内容。

Sample Processing:To process the sewage sample。

200ml of the sample was ___ on the filter membrane were washed off with 100ml of 2x concentrated SF (selenium salt ___ at 37℃ for 24-48 hours。

us colonies ___ at 37℃ for 18-24 hours.n:___.Report Number:Format: ZG-XJ-JLBacterial Count Test Report:Sample Name:Testing Date: n Date:n: xxxxxxxx0Colony Count: xxxxxxxxxxxxxxxx CFU Average Count: (CFU)Result: (CFU)___:___:Report Number:Format: ZG-XJ-JL___ Report:Sample Name: Testing Date: n Date: n: xxxxxxxx0Initial ___ gas n:Re-___:MPN table result:___:。

固定酶底物法应用于污泥粪大肠菌群的检测摘要：目前污泥中粪大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法，这两种方法均是根据总大肠菌群具有的生物特性，经过初发酵、平板分离、革兰氏染色镜检、复发酵的过程检测污泥中粪大肠菌群的数量。

传统方法检测前须准备大量培养基，检测耗时长，有诸多缺点。

现希望通过将固定酶底物法应用于污泥中粪大肠菌群的检测，缩短检测时间，节省人力成本，提高检测效率和检测的准确率。

关键词：污泥粪大肠菌群滤膜法固定酶底物法随着科学技术的发展，城镇化进程的加快，城镇生活污水总量逐年提高，从而导致产生的大量的污泥[1]。

粪大肠菌群是城镇污水处理厂污泥泥质控制的一项重要指标[2]。

粪大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示样品中有否有粪便污染。

粪大肠菌群数量的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

在CJ/T221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》中城市污泥粪大肠菌群的检验采用滤膜法测得[3]。

该方法使用新滤膜前需对滤膜进行鉴定，同时对滤膜上形成的不典型或疑难的菌落须进行涂片、革兰氏染色和镜检，另一部分接种于EC培养基看是否产气。

由此可见，滤膜法检测污泥粪大肠菌群非常繁琐，需要较长的时间获得准确的检测结果。

随着酶底物技术的发展，固定底物酶底物法越来越多地应用于检测水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌、耐热（粪）大肠菌群，是GB/T5750.12-2006的国标方法[4]。

污泥粪大肠菌群的检测同样是通过无菌水逐级稀释检测。

因此，希望通过运用固定底物酶底物法检测污泥粪大肠菌群，以便更快捷的方式获得准确的检测结果。

1 材料与方法1.1材料培养基：M-TEC培养基、EC培养基、酶底物试剂（含97孔定量盘）仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、程控定量封口机、干热灭菌箱、振荡器、滤膜过滤装置其他：75mm平皿、接种环、革兰氏染色试剂盒、移液枪、试管、无菌瓶、无菌水、滤膜（孔径为0.45μm）、1L烧杯、火焰枪1.2样品采集和制备1.2.1取样方法采用多点取样混合，样品质量不小于1kg。

一、微生物分析的总体要求（一）、采样瓶及玻璃器皿的清洗1、新购置的玻璃器皿，因含游离碱，2%的盐酸浸泡数小时，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。

2、培养细菌后的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。

3、洗涤吸管时可高压蒸汽灭菌30min，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。

用牛皮纸包好，可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。

备用。

所有的吸管上端要用少量普通棉花填塞，注意松紧度，取液时使其准确快速的流出）4、洗涤采样瓶时，用刷子刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，再烘箱烘干，用牛皮纸包好（鸡肠带捆好），可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）5、培养皿：洗净后，用烘箱烘干，用牛皮纸包好进行灭菌，待冷后放入冰箱中备用。

（二）、培养基的制备1、单倍乳糖蛋白胨培养液-液体培养基用量筒量取1000mlUP水，加23g营养物质，沿烧饼边沿搅拌，使其完全溶解。

用移液管移取9ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。

2、三倍乳糖蛋白胨培养液：营养物质加入69g，用移液管移取5ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。

3、EC培养液（配制过程同乳糖蛋白胨培养液）(称取37g)-液体培养基4、无菌水，吸取9ml新鲜UP水于试管中，其余包扎过程同乳糖蛋白胨培养液。

5、上述培养基及无菌水准备好后高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。

灭菌后等室温再放入冰箱。

6、伊红美蓝培养基（EMB培养基）(固体培养基-平板)①称取42g营养物质，加入到1000mlUP水中，加热溶解，用三角瓶分装，盖上绵塞，至于高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20min。

监测的过程中一定要根据细菌学监测的特殊性以及大肠菌群测试特性分布及监测过程存在的问题，要提出强化质量控制，并且对环境卫生防护有一定的对策和措施。

同时也应该强化监测人员环境卫生安全的防患意识，进入实验室要穿戴防护服和防护器具，避免人体与实验废液直接接触。

同时在检测的过程中，尽量采用一次性实验器皿用具，实验固体废弃物，按照传染病医院医疗固体废弃物处置方法来进行处置。

1 材料与方法1.1 仪器与试剂乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基、革兰氏染液、松柏油和无菌生理盐水。

恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、酒精灯、振荡器、可调式电炉、天平(感量0.01g)。

1.2 试验方法1.2.1 空白试验不加污泥样品，按照试样测定的全部步骤，进行大肠菌群的测定，接种培养后无产酸产气，即空白检验合格。

1.2.2 样品的采集与预处理采集天津市周边20个污水处理厂污泥，含水率范围为69.6%～95.4%。

现场将污泥采集于经干热灭菌处理的广口玻璃瓶中，采集后保存于4℃冷藏箱中，于24h 内送检。

称取污泥样品1.00g ，放入装有9mL 灭菌生理盐水的试管内，充分摇匀，制成1:10的均匀菌液。

再将此菌液倒入装有90mL 生理盐水的三角瓶中摇匀，制成1:100的均匀菌液，如此操作，依次配制10倍稀释菌液。

0 引言污水处理厂污泥是污水处理厂在净化污水过程中产生的沉淀物，其中含有大量需氧菌和异养菌[1]。

我国污水处理厂对污泥稳定化处理中粪大肠菌群的限值规定执行GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》。

目前，对于污泥中粪大肠菌群的检测以多管发酵法较为普遍，本文依据CJ/T 221—2005《城市污水处理厂污泥检验方法》对多管发酵法测定污泥中粪大肠菌群进行了精密度和准确度的验证，为该方法的可靠性和准确性提供了技术支持。

本文是通过采用多管发酵法对总大肠菌群来进行对比实验，比较它们结果的一致性。

要测定污泥中细菌总数对判断污泥被污染程度，污水处理厂污泥排放是否符合标准，具有重要的意义。

粪大肠菌群的监测分析1.粪大肠菌群粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，用来表明水质受污染的程度，主要来自粪便。

粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5 ℃培养24~48ｈ能发酵乳糖产酸产气。

通过对粪大肠菌群的监测，可了解水体受生活污水污染的状况。

粪大肠菌群适用于河流、湖泊等地表水、企业污水及医院废水的监测，是综合评价城镇污水，尤其是生活污水污染的一个必不可少的重要指标。

粪大肠菌群作为地表水环境质量标准唯一的一项微生物监测指标，我国多用多管发酵法进行检测，近几年也更新了好几个相关环境标准。

２样品的采集和保存2.1 采样瓶的准备和存放采集粪大肠菌群的采样瓶需要用牛皮纸封包好后，再经过高压灭菌器灭菌才能使用。

灭菌后的采样瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。

有条件的单位，也可以使用无菌采样瓶。

灭菌后的采样瓶也有其保存期，超过两周内未使用就必须重新灭菌。

绝大部分实验室都是在首次灭菌后不再管其使用期限。

采样瓶存放过久可能受到杂菌污染。

2.2 样品采集采样人员大多缺乏细菌学监测知识，出现很多采样不规范的现象。

如：微生物项目水样和理化水样混采；灭菌瓶开盖时间过早、水样在空气中暴露时间过长；水样采集量过满（既容易导致水样中细菌缺氧死亡，又不利于水样检测前振荡摇匀）；微生物样品和其他理化项目同时采样时，没有做到细菌样品优先采集；采样人员在采集样品时，没注意避免采样瓶受杂菌污染（手接触到瓶盖和瓶颈、采样设备不规范）。

2.3 样品运输保存在样品的运输和保存过程中，样品的冷藏是关键（温度过高过低都不利于样品的保存）。

由于仪器设备条件不够，运输过程不满足样品所需温度或者路途遥远，送检时间超过６ｈ，都会导致样品失效。

样品交接时间过长（在样品送入实验室之后，采样人员要将采样记录移交给业务室，然后由接样员对水样进行编号并将检测任务下发到监测室），导致样品没有及时分析而超过时限。

水质总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数监测技术规范1 范围本文件规定了水中总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数的术语和定义、采样技术要求、分析技术要求、质量控制要求、监测记录、注意事项等技术内容。

本文件适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数的监测。

2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 14848 地下水质量标准GB 3838 地表水环境质量标准HJ 1000 水质细菌总数的测定平皿计数法HJ 1001 水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法HJ 164 地下水环境监测技术规范HJ 347.1 水质粪大肠菌群的测定滤膜法HJ 347.2 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法HJ 630 环境监测质量管理技术导则HJ 755 水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范HJ 91.1 污水监测技术规范3 术语和定义3.1 总大肠菌群 total coliforms参照HJ 755定义为：37℃培养，24 h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。

3.2 粪大肠菌群 fecal coliforms又称耐热大肠菌群（thermmotolerant coliforms ），参照HJ 755定义为：44.5℃培养24 h，能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽抱杆菌。

3.3 细菌总数 total bacteria参照HJ 1000定义为：36℃培养48 h，样品在营养琼脂上所生长的需氧菌和兼性厌氧菌菌落总数。

4 采样技术要求14.1 样品采集4.1.1 地表水附近有桥梁的河流断面宜在桥上采样，湖库点位和水体较深的河流断面宜采用船只采样，水深较浅的河流断面宜涉水采样，按照HJ/T 91的相关规定执行。

PH参考方法：城污水处理厂污泥检验方法 CJ/T 221-2005 4 PH的测定电极法一、原理PH由测量电池的电动势而得。

以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极组成电池。

在25℃条件下，溶液中每变化1个PH单位，电位差改变为59.16mV，据此在仪器行直接以PH的读数表示。

温度差异在仪器上没有补偿装置。

用无CO2水浸泡污泥样品，最终使污泥中的[H+]完全转化至水中，达到凝固平衡后，测定此时的PH值。

二、样品制备对于脱水后的污泥样品称取 5.00g置于150ml具塞磨口锥形瓶中，加入50mlCO2水浸泡，密封。

置于复式振荡器上，于室温下振摇4h后，离心5min，取上清液作为待测液。

对于含水率大于99%的污泥，可直接将玻璃电极插入测定，但侧低昂数值至少要保持恒定30s。

对于不溶解粘稠状的污泥，则将样品进行离心5min后，收取足够量上清液于量筒中，作为待测液。

三、测试程序1、样品测定用PH酸度计测定经处理后的样品待测液的PH值，记录结果。

2、结果表示PH值一般保留一位小数。

四、精密度和准确度经过7个实验室，对13个样不同浓度污泥样品PH值进行测定，实验室内相对标准偏差为0.07%～0.74%含水率参考方法：城污水处理厂污泥检验方法 CJ/T 221-2005 2 含水率的测定重量法一、原理将均匀的污泥样品放在称至恒重的蒸发皿中水浴上蒸干，放在103℃～105℃烘箱内烘至恒重，减少的重量以百分率计为含水率。

二、样品制备测定含水率的样品应剔除各类大型纤维杂质和大小碎石块等无机杂质，特别注意样品的代表性。

采集的样品应放入密封容器尽快分析。

如需放置，应在密封贮存4℃冷藏冰箱中。

三、测试程序1、分析条件天平感量：0.001g 烘箱:0～300℃干燥器蒸发皿:100ml2、样品测定将已恒重为m1的蒸发皿称取经捣碎均匀的污泥样品约20g，精确至0.001g 记为m。

将盛有污泥样品的蒸发皿至于水浴上蒸干，放入烘箱中干燥2h，取出放入干燥器内冷却至室温，称重，反复多次，直至恒重记为m2。

医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法A1 仪器和设备高压蒸汽灭菌器。

干燥灭菌箱。

培养箱：37℃。

恒温水浴箱。

电炉。

天平。

灭菌平皿。

灭菌刻度吸管。

酒精灯A2 培养基和试剂乳糖胆盐培养液A2.1.1成分蛋白胨20g猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g乳糖5g％溴甲酚紫水溶液蒸馏水1000mLA2.1.2 制法将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到，加入指示剂，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。

115℃下灭菌20min。

贮存于冷暗处备用。

三倍浓度乳糖胆盐培养液A2.2.1成分蛋白胨60g猪胆盐（或牛、羊胆盐）15g乳糖15g％溴甲酚紫水溶液蒸馏水1000mLA2.2.2 制法制法同附录A2.1.2。

伊红美兰培养基（EMB培养基）A2.3.1 成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20g2％伊红水溶液20mL％美蓝水溶液13mL蒸馏水1000mLA2.3.2 制法将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使溶解，再加入蒸馏水补足至1000mL，调整pH至～。

趁热用脱脂棉和砂布过滤，再加入乳糖，混匀，定量分装于烧瓶内，115℃灭菌20min。

作为储备培养基贮存于冷暗处备用。

临用时，加热融化储备培养基，待冷至60℃左右，根据烧瓶内培养基的容量，加入一定量的已灭菌的2％伊红水溶液和％美蓝水溶液，充分摇匀（防止产生气泡）。

倾注平皿备用。

乳糖蛋白胨培养液A2.4.1成分蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g％溴甲酚紫乙醇溶液1mL蒸馏水1000mLA2.4.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到～，加入％溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。

115℃下灭菌20min。

贮存于冷暗处备用。

革兰氏染色液A2.5.1 结晶紫染色液结晶紫1g95％乙醇溶液20mL1％草酸铵水溶液1000mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵水溶液混合。

污泥采样、样品处理、监测指标与频率、指标分析方法
A.1污泥采样
污泥好氧堆肥法采样应符合下列规定：
1对于静态好氧堆肥，采样工作应紧跟在堆体翻堆后进行。

根据堆体长度，均匀选取若干个垂直于堆体径向中线的取样断面（最少不少于5个断面），取样断面应依次分布于堆体径向中线两侧，具体布设规则见图1；采样时，在每个取样断面的形心处采集样品，单个样品重量应不小于1kg；
图1污泥好氧堆肥法采样示意
2对于动态连续或间歇式好氧发酵，应在一次出泥物料中采集5个污泥样品，单个样品重量应不小于1kg；
3对于计划出厂的堆肥产物，采样方式为：于计划出厂的物料中随机采集10个污泥样品，单个样品重量应不小于1kg,每个样品采集点距堆体表面距离不小于30cmo
A.2样品处理
应将所取的样品快速等体积混匀，再用四分法缩分，即将样品混合并摊平成正方形，沿两条对角线将样品切成四份，取对角线的两份，为一次缩分；再将对角线的两份样品混合摊平成正方形，继续沿两条对角线切成四份，取对角线的两份，依次类推重复若干次，缩分后的样品应满足至少3次重复检测需要。

A.3监测指标与频率
A.3.1过程跟踪指标
污泥好氧堆肥法处理过程跟踪指标见表A.3.1o
A.3.2出厂控制指标
污泥好氧堆肥法产物出厂控制指标见表A.3.2o
A.4指标分析方法
污泥好氧堆肥法指标分析方法见表A.4o。