《动物基因工程》PPT课件 (2)

了抗虫的相关特性
提示:①-c;②-a;③-b。
探究一 目的基因的筛选与获取
PCR 反应的分析 (1)PCR 反应过程通过高温使双链 DNA 分子间的氢键打开,此过程不需要解旋酶。 (2)在 PCR 反应过程中需要控制不同的温度,高温变性,低温复性,中温延伸。 (3)耐高温的 DNA 聚合酶只在延伸过程中发挥作用,而其他两个过程不需要酶的参与, 但是耐高温的 DNA 聚合酶的最大耐受温度应高于 PCR 反应体系的最高温度。
第3章 基因工程
第 2 节 基因工程的基本操作程序
学习目标
1.结合转基因抗虫棉的培育过程,阐明基因工程的基本操作程序。 2.结合 DNA 复制过程,说出 PCR 反应所需要的条件,并能描述 PCR 扩增的过程, 培养归纳、比较等分析问题的能力和科学探究的能力。 3.通过分析示意图或资料,描述基因表达载体的构建过程,并尝试构建一个完 整的基因表达载体。 4.运用归纳和比较的方法,概述将目的基因导入受体细胞的方法以及目的基因 的检测与鉴定方法,进而培养归纳、比较等分析问题的能力。 5.通过实验“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”,进一步明确 PCR 扩增过程,说明各 成分和操作步骤的意义,并用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果,提升科学探究能 力。
【例 1】利用 PCR 将某小段 DNA 分子扩增 n 代,需 ( )
②操作过程。
a.从新鲜叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养 筛选转化细胞 再生成植株。
b.将花序直接浸没在含有 农杆菌 的溶液中 培养植株并获得 种子 筛选、
鉴定。
(3)花粉管通道法。
①用微量注射器将含 目的基因的 DNA 溶液 直接注入子房。
②植物受粉一定时间内 剪去 柱头 将 DNA 溶液滴加在花柱切面上 目的基因

ＣＣＴＴＣＡ
探针
１、核酸分子杂交的基本原理
① 基本原理： 碱基互补原则 ② DNA 的变性与复性
变性 导致 DNA 两条链之间的氢键 断裂，而核酸分子中的所有共 价键不受影响，称为DNA变性。
复性 去除DNA变性因素，两条DNA 链
重新结合成DNA双螺旋结构， 称
２、核酸分子杂交的基本方法
类型
待测核酸片段 探针
基因工程的优越性
1、可在亲缘关系极远的生物之间 进行，能大幅度地改变生物遗 传特性
2、能定向地改变生物遗传特性 3、能快速和稳定地获得新品种
二、基因工程的主要工作
（一）工具酶 （二）载体 （三）主要工作
（一）工具酶
类型
限制酶 修饰酶
1、限制酶
（restriction enzyme）
全称： 限制性内切核酸酶 功能： 识别双链 DNA 内部特异部位
杂交
X底片
Southern 杂交法
（二）核酸的体外扩增
（polymerase chain reaction , PCR）
聚合酶链反应技术
1、目的 在体外快速精确扩增基因组 DNA 2、原理 碱基互补原则， DNA复制 3、优点 ：
① 反应体系相对简单 ② 准确性高 ③ 时间短
4、基本过程
通过改变温度引起的重复进行 DNA 复制 的过程 ① 变性： 95ºC 左右 ② 退火： 引物 Tm 值 ③ 延伸： 70ºC 左右
裂解磷酸二酯键 来源： 原核生物细胞中分离
限制酶特点：
① 具有识别专一性和特异性（4—6个 bp ） 如：EcoRⅠ 5´-- G A A T T C -- 3´
BamHⅠ 5´-- G G A T C C -- 3´ HindⅢ 5´-- A A G C T T -- 3´ ② 具有特定的酶切位点 ③ 切交割错方切式割

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失去磷酸二酯键的缺口 连接酶封闭缺口
缺失核苷酸的缺口 连接酶无法封闭缺口
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平末端DNA片段的末端加尾连接法
5’
3’
5’
3’
3’
+dATP
5’
末端核苷酸转移酶
3’ +dTTP
5’
5’
5’
3’
AAAAA 3’
3’ TTTT
3’
5’
5’
DNA聚合酶和
T4DNA连接酶
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5 核酸酶
核酸酶S1(nuclease S1) 核酸外切酶Ⅲ
经PCR扩增后，扩增产物有多少个碱基？
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分析
1 CTGAAGAAGAGACAAGTTTTGGGACTGGTGACAATTGTCTAGAGAGCATG GACTTCTTCTCTGTTCAAAACCCTGACCACTGTTAACAGATCTCTCGTAC
51 GAGGGCCATGTCAAGCGCCCCATGAATGCATTTATGGTGTGGTCCCGTGG CTCCCGGTACAGTTCGCGGGGTACTTACGTAAATACCACACCAGGGCACC …………………………………………………………………
Xba I
300bp 500bp
600bp 150bp
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酶切反应的基本步骤
加反应液 37℃ 1h
电泳
－
CK T M
CK T M
紫外分析
＋
Buffer (10×) 2.0 µL
Water
16.5 µL
DNA
1.0 µL
1.0kb
Enzyme
0.5 µL
Volume
20.0 µL

(7)用于载体的质粒 DNA 分子上至少含一个限制酶识别位点(√ )
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在
并表达
(√)
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
2．载体需具备的条件及其作用(连线)
对点落实
返回
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了
EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和 Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列
与 切 割 位 点 ， 图 (b) 为 某 种 表 达 载 体 的 示 意 图 ( 载 体 上 的
EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓
↓
↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
返回
(2)写出产生的末端的种类：①产生的是黏性末端；②产生的 是 平末端 。 (3)EcoRⅠ限制酶和 SmaⅠ限制酶识别的碱基序列 不同，切割 位点不同 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性 。
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
图(b)
图(c)
(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的
有__E_·_c_o_l_i__D_NA_连__接__酶_和____T_4D_N_A_连___接__酶___，其中既能连接黏 性末端又能连接平末端的是__T_4D_N_A__连__接__酶___。
解析
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么

微注射的转入基因常要删除原核载体序列的线性 DNA。在哺乳动物中，精子进入卵细胞后的l h内， 精前核和卵细胞的核都是分开的。等到卵细胞核完 成减数分裂，成为卵前核时，核融合才进行，这称 为核配。 DNA 微注射要在精前核时注射才能有效。 精前核比卵前核更大，因此可在显微镜下找到处在 精前核状态下的受精卵。
转基因动物
1 、 1982 年， R.D.Palmiter 等采用显微注射法，将 大鼠生长基因导入小鼠受精卵的雄原核内，得到转 基因小鼠以来，成功构建了各种转基因动物。 2、转基因动物技术具有广泛的应用：研究基因的 表达与功能，生产生物大分子；生产人体蛋白；改 良动物；医用转动物模型。 3、转基因人的研究只能限于体细胞的基因治疗， 具有遗传特征修饰的转基因人的研究，可否迈出历 史的一步？问题多多。 4、动物基因转移无论用何技术，转移效率极低。
（八）动物转基因的意义
1. 应用于动物基因组结构与功能的研究 (1) 以报告基因为转基因探测动物或人基因组中时空 特异性表达调控序列； (2) 以反义基因为转基因灭活相关的内源基因，构建 基因表达缺陷——功能丧失的动物模型； (3) 以同源基因为转基因体内检测其表达特性及产物 的生物效应。 2. 转基因技术改良动物物种 3. 对人体中数千种分子病的基因治疗 4. 利用此技术构建优异的动物反应器
（四）动物基因的表达特性
1. 转基因的时空特异性表达 动物基因表达调控的显著特性：时空特异性， 特别是在发育过程中，相关基因的时序特异性和组 织特异性表达更为严格。 2. 转基因的可控表达 诱导动物细胞内的转基因，对其稳定高效表达 至关重要，转基因的诱导条件取决于受体细胞的性 质和启动子的类型。 3. 转基因的共抑制效应 在转基因动物体内，转基因的表达常会发生转 基因的失活，也称为转基因沉默。

(2)基因表达载体的构建
特别提醒：①插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体 的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。 ②两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互 补，便于连接。
类 植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2＋处理法
形成重组 形成新的 DNA分子 DNA分子
解旋酶
DNA 分子 碱基对间 的氢键
将DNA 两条链之 间的氢键 打开
形成单链 DNA分子
(2)限制酶与DNA连接酶的关系
①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识 别序列或识别序列已经被修饰。 ②DNA连接酶起作用时不需要模板。
2．载体 (1)作用 ①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。 ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 (2)具备的条件 ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。 ②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。 ③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。
质粒
小型双链环状
标记基因
λ噬菌体的
将目的基 因导入受 体细胞 （转化）
答案： 农杆菌转化法 显微注射法 插入了目的基因 转 某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体细菌的 群体中储存，各个受体看一看：某研究小组在利用基因工程改造棉花时，发现转入的目的 基因始终不表达，其原因可能是什么？ 答案：构建基因表达载体时，可能没有加入启动子。
(3)种类 ①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自 我复制的很小的双链环状DNA分子。 ②λ噬菌体的衍生物。 ③动植物病毒。 特别提醒：①一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因 此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。 ②限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才 能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。

想而知。
将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每 2000L培育液就能产生100g胰岛素！大规 模工业化消费不但处理了这种比黄金还 贵的药品产量问题，还使其价钱降低了 30%-50%!
胰 岛 素 消 费 车 间
干扰素治疗病毒感染几乎是“万能灵药 〞！过去从人血中提取，300L血才提取 1mg！其“珍贵〞程度自不用多说。
我们人类赖以生存的地球在亿万年 的演化过程中, 孕育出了天姿多态的生 命，丰富多彩的有机世界聚集着活力勃 勃的遗传信息，这就是------基因。
基因——遗传信息的传寄将永远承 继下去，世世代代，直到很远，很远的 未来。
那么，有人担忧有朝一日全部生物 都灭绝了，我们人类怎样办--？--？-？
思索题：
这种措施只能用于控制在实验室里的转基
因生物，而且用于控制转基因微生物和经过 花粉进展分散的植物的效能实践上是非常有 限的。当转基因动、植物必需用于开放的环 境里消费时，物理控制的方法便不再有实践 的意义。
基因工程的平安措施：
根本性的措施还是生物学的控制方法。 即呵斥转基因生物与非转基因生物之间的生 殖隔离。如利用三倍体不育的特性，将用于 消费的转基因动物或植物成为三倍体，这样， 转基因生物在进入到自然环境里后就不能够 自行繁衍，因此也就不能够对生态系统 呵斥 长期的影响。也可以利用生理学原理，如激 素诱导等方法使转基因生物不育等。
根本定义：
将一种生物体〔供体〕的基因与载体 在体外进展拼接重组，然后转入另一种生 物体〔受体〕内，使之按照人们的志愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体 外操作程序，也称为分子克隆技术。因此， 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大 根本元件。
基因工程的本质：
是利用重组技术，在体外经过人工“剪 切〞和“拼接〞等方法，对各种生物的基 因进展改造和重新组合，然后导入微生物 或真核细胞内进展无性繁衍，使重组基因 在细胞内表达，产生出人类需求的基因产 物，或者改造、发明新的生物类型。

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动物基因工程未来的展望
• 以基因工程为核心的分子生物学技术应用于动物营养学研究领域 ，具有很大的潜力，它不仅为动物营养学研究提供了一套全新的 技术和方法，而且可在基因水平上解决许多动物机体生理病理变 化、营养素的代谢调节机制以及其与机体的相互关系等问题。我 们可以设想，基因工程抗菌肽完全可以减少甚至替代抗生素的使 用；随着转基因技术的日益完善，各种生物性能优越的动物新品 种将层出不穷；用转基因动物来大量生产各种生理活性物质，也 将成为现实。无可置疑，21世纪是高新技术畜牧业应用大发展的 时期，以基因工程为主导的分子生物学技术将会为我国的畜牧业 的发展开辟广阔前景。
应用前景
据了解我国血友病B 发病率为1 / 100 000，故利用乳腺生物 反应器生产人凝血因子IX 在我国具有广阔开发前景和快速的经济 效益。
目前，人们利用转基因动物乳腺生物反应器生产hFIX，已取 得了可喜的成绩。但人们首先还应该在表达载体构建方法上进一 步改进，更有利于大规模生产hFIX；其次，还应该解决转基因动 物的低效率，目的基因的低水平表达及随机整合等问题；再者， 还应该在产品的纯化技上有所突破，目前国内外均无成熟的纯化 技术，但是双水相体系用于分离纯化hFIX 纯度高达95%以上，有 望成为分离纯化转基因药物的新技术。总之，随着新科技的不断 开发与应用，乳腺生物反应器必将成为一种简便、大量、低成本 的生产药用蛋白的方法最终形成一种全新的生物医药产业。这也 将推动我国的转基因药物在21 世纪的生物医药产业革命中占有一 席之地。
现代食品生物技术
基因工程在动物中的应用
食工0901班
2012年3月20日
编辑版pppt
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动物基因工程
从1980年初第一个转基因鼠诞生至今， 动物转基因技术的研究仅有十多年的历史， 但已在动物遗传育种、抗病育种等方面取 得了突破性进展，研究对象包括猪、绵羊、 牛、山羊、鸡、鸟类、鱼等。