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超广谱β-内酰胺酶检测方法筛选张保才;颜秉兴;郭萍;袁志军;李秋荣;孟宪君;沈莉;李青鞠【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2002(037)001【摘要】目的:优选检测超广谱β-内酰胺酶简单、有效和实用的方法,为临床合理使用抗生素提供可靠依据.方法:初筛试验以头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶和氨曲南为底物,确证试验采用双纸片协同试验、三维试验、E-test、2种单纸片确证试验.结果:采用双纸片协同试验、三维试验、E-test、头孢噻肟加克拉维酸、头孢他啶加克维酸、头孢噻肟加舒巴坦、头孢他啶加舒巴坦对可疑产ESBLs的检出率分别为77.14%(81/105)、50.48%(53/105)、51.43%(54/105)、82.86%(87/105)、77.14%(81/105)、61.90%(65/105)、58.10%(61/105).头孢噻肟和头孢曲松对产ESBLs菌的检出率较高.结论:双纸片协同试验和单纸片加克拉维酸试验操作简单、检出率高,适用于各级医院对产ESBLs菌的检测.头孢噻肟和头孢曲松为最佳指示底物.【总页数】2页(P84-85)【作者】张保才;颜秉兴;郭萍;袁志军;李秋荣;孟宪君;沈莉;李青鞠【作者单位】中原油田总医院检验科,濮阳,457001;中原油田总医院检验科,濮阳,457001;中原油田总医院检验科,濮阳,457001;中原油田总医院检验科,濮阳,457001;中原油田总医院检验科,濮阳,457001;中原油田总医院检验科,濮阳,457001;中原油田总医院检验科,濮阳,457001;中原油田总医院检验科,濮阳,457001【正文语种】中文【中图分类】R446【相关文献】1.120例肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶酶的检测及耐药性 [J], 付云杰2.介绍一种同时存在AmpC酶和超广谱β内酰胺酶的检测方法 [J], 原英;徐英春;陈民钧3.细菌广谱β-内酰胺酶与超广谱酶对头孢哌酮的水解作用及两种酶抑制剂的抑酶效应 [J], 张翔;雷军;袁斌;刘刚;凌保东4.单产超广谱β-内酰胺酶和同时产超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶肺炎克雷伯菌的临床分布与耐药性分析 [J], 杨义灿;李艳;李从荣;顾剑;汪明5.细菌β内酰胺酶诱导酶及超广谱β内酰胺酶的耐药性检测 [J], 孔庆莲;于秀娟;郑玉兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
β-内酰胺类抗生素β内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用专家共识（2020年版）一、概述革兰阴性菌及少数革兰阳性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的最重要机制是产生各种β-内酰胺酶。
β-内酰胺酶抑制剂能够抑制部分β-内酰胺酶，避免β-内酰胺类抗生素被水解而失活。
因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂（简称β-内酰胺酶抑制剂复方制剂）是临床治疗产β-内酰胺酶细菌感染的重要选择。
我国临床使用的β-内酰胺酶抑制剂复方制剂的种类和规格繁多，临床工作者对该类制剂的特点了解参差不齐，临床不合理使用问题比较突出。
二、主要β-内酰胺酶及产酶菌流行情况β-内酰胺酶是由细菌产生的，能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。
β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有两种：一、是根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），其将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC酶）和碳青霉烯酶等；二、是根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶（包括A类、C类酶和D 类酶）及金属酶（B类酶）。
目前引用较多的是1995年Bush等基于上述二种方法建立的分类方法，2019年Bush等又将该分类表进一步完善和细化（表1）。
其中临床意义最大的是下列三类β-内酰胺酶：表1 常见β-内酰胺酶分类及特点，常见酶抑制剂抑酶活性1、ESBLs主要属2be\2br\2ber类酶，是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。
ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。
根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、CTX-M 型、OXA型和其他型共5大类型。
2、AmpC酶属C类酶，通常由染色体介导，可以被β-内酰胺类抗生素诱导。
金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。
金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。
酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。
底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。
金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。
一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。
20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。
这些酶都由染色体基因编码。
该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。
1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。
现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。
金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。
金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。
酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。
底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。
金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。
一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。
20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。
这些酶都由染色体基因编码。
该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。
1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。
现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。
外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质。
违法使用的目的，是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。
但是，内源性β-内酰胺酶的产生机理也是科学研究基本确认的事实。
近几十年来，国际国内畜牧业养殖奶牛过程中无限制使用大环内脂类抗生素治疗动物、家禽等食用动物各种炎症、败血症、水肿病等病症，造成革兰氏阳性细菌对抗生素耐药，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性一般通过4种途径。
（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。
目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。
（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。
当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。
PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。
（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。
如生物膜的形成。
（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。
由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的分别鉴定检测技术尚未见报道。
而目前各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法无论是化学仪器分析高效液相色谱法还是微生物法，其检测原理都是：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加的或是耐药细菌产生的。
奶制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。
耐药性产生的机理很复杂，细菌耐药基因的转移、共生菌协同以及基因交叉耐受，等影响都要考虑。
另外，根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，建议加强畜牧业奶业生产全过程，而终产品的β-内酰胺酶检测始终是一个辅助手段，凭检测结果很难处理。
化学家们要尽快建立内源性和外源性β-内酰胺酶的分离鉴定技术，当然这种技术要求是非常高的 1.常规方法(1).微生物法：[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。
[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼脂平板内。
然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。
放置35℃培养24小时后观察结果。
[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕(2).碘量法[3] [原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。
[方法] ①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。
取0.1ml
于一小试管中。
②将培养18-24小时的细菌在含青霉素试管内制成浓厚菌悬液（109/ ml）。
③在37℃水浴中放置30分钟，不时摇动，使酶能破坏青霉素。
④加入1%可溶性淀粉溶液0.5 ml，摇匀。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分钟，观察结果。
[结果] 在10分钟内能使兰色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。
[注意事项] ①由于青霉素很容易分解，因而用于实验的青霉素应新鲜配制。
②淀粉也新鲜配制，在100 ml蒸馏水中加入1克可溶性淀粉，放到开水中水浴直到淀粉溶解。
③实验应按照步骤操作，如果碘加得过早，酶反应就会停止，产生假阴性结果。
④每次试验最好用阳性和阴性对照。
（3）.纸片酸度定量法[3] [原理] β-内酰胺酶能破坏青霉素中的β-内酰胺环，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示剂溴甲酚紫颜色由紫变黄。
[方法] ①将一小片Whatman滤纸放于空平皿中。
②让滤纸吸足青霉素溶液（0.05M磷酸缓冲液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%无缓冲剂的结晶青霉素）。
③用接种环把10-20个菌落涂到滤纸上，④盖好平皿后，将滤纸片在37℃孵育30分钟，观察结果。
[结果] 产β-内酰胺酶的菌株使滤纸颜色由兰色变黄色，一般在10分钟内即能看到。
（4）.产色头胞菌素法[4] [原理] 产色头胞菌素如头胞硝噻吩（nitrocefin）的β-内酰胺环能被β-内酰胺酶所破坏，使其颜色由浅黄色变为粉红色，以此来测定细菌的产酶情况。
[方法] 将头胞硝噻吩（nitrocefin）纸片置于干净的平皿内，用无菌的牙签或接种环挑取细菌菌落涂于纸片上，观察纸片有无颜色变化。
[结果] 纸片涂抹处如颜色由浅黄色变成粉红色，表示该菌产生β-内酰胺酶，如颜色不变，表示细菌不产生β-内酰胺酶。
检测β-内酰胺酶方法中，生物学方法是古老的方法，由于特异性差、灵敏度低，现在基本上很少被采用，头胞硝噻吩（nitrocefin）主要检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）、葡萄球菌，结果可靠。
纸片酸度定量法一般用于检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌。
碘量法常用于检测淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉汉氏菌）只能用头胞硝噻吩（nitrocefin）法。
对于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）快速测定β-内酰胺酶比做药敏试验能更快地得到临床需要的结果。
β-内酰胺酶试验还可验证葡萄球菌对纸片法青霉素的敏感试验结果是否可信。
肠杆菌科、假单胞菌科及其它需氧革兰氏阴性杆菌不必测定β-内酰胺酶，因其结果常常不能预测这类细菌对临床常用来治疗β-内酰胺类抗生素药物的敏感性[5]。
