碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探

碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探高玉千，李林柯，刘琦（河南农业大学生命科学学院，郑州，450002）摘要：从四个不同地点采集的土壤样品中，平板分离初筛到9株蛋白酶产生菌，进一步复筛得到一株高产且稳定的碱性蛋白酶菌株B4，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

实验证明其最佳产酶pH8.5，水解温度53℃，发酵时间60h，为下一步进行碱性蛋白酶基因的克隆和诱变奠定基础。

关键词：枯草芽孢杆菌，碱性蛋白酶，筛选Studies on Isolation of Alkaline ProteaseGao Yu-qian, Li Lin-ke, Liu Qi(College of Life Sciences, Henan Agriculture University, Henan, Zhengzhou, 450002) Abstract：9 producing alkaline protease strains were isolated from soil samples, within one strain named B4 was selected and identified as Bacillus subtilis.The optimum conduction for the protease producing consisted of pH8.5, 53℃ and after 60h fermentation. The research could do good preparation for the clone and the mutagenesis of the protease-gene.Keyword：Bacillus subtilis alkaline protease screening蛋白酶是一种重要的酶制剂，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。

20世纪末国际市场上商品蛋白酶多达80多种，其销售额占酶制剂总销售额的60%以上，而微生物碱性蛋白酶又占了整个蛋白酶40%左右的市场份额，被认为是最重要的应用型酶类[1]。

虽然人们对蛋白酶的研究和利用已有多年的历史，但仍存在蛋白酶制剂品种单一、价格昂贵等问题，加上各国都十分注重对已有的重要微生物资源的保护，使得产酶优良菌株的筛选和选育仍是重要的课题，特别是对于发展中国家更是如此[2，3]。

本研究从土壤入手，筛选产碱性蛋白酶的高产菌株，并对其酶学性质进行系统的研究，为下一步获得碱性蛋白酶的基因并得到表达；对蛋白酶基因进行诱变以进一步提高酶活力奠定基础。

l 材料与方法1.1 材料1.1.1样品来源从河南农业大学校园、郑州奶牛场、菜园、杜邦大豆蛋白公司采集土壤样品4个。

1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基用于分离细菌菌落；LB培养基用于菌株的保藏及平板筛选；含1%脱脂奶的L B固体培养基（脱脂奶培养基）用于检查菌株产蛋白酶情况；产酶发酵采用3%豆粕粉的豆粕培养基。

1.2 主要仪器与设备SCS-24型和THZ-82型恒温振荡培养箱、SW-CJ-IC型净化工作台、CS501A型超级恒温器、pHS-3C 型数字型精密pH计、721型分光光度计、Sigma公司产3K30型冷冻超速离心机等。

1.3 方法1.3.1土壤样品的采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取500g土壤，装入塑料袋内，备用[4]。

1.3.2 菌株的分离取50g土壤样品置于250ml三角瓶中，加入100ml无菌水，用玻璃棒搅拌，静止15min后，涂布于豆粕培养基上，置于37℃培养箱中培养60h。

然后根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘形状和菌落颜色[5]，最终挑选出若干个细菌菌落。

1.3.3 菌株的筛选分离到的菌株采用常规稀释平板法分别接种于脱脂奶培养基，置于37℃培养60h。

室温下观察接种的菌株是否分解培养基中的脱脂牛奶，进而产生肉眼可见的水解透明圈，即可产生分泌胞外蛋白酶。

将可产生透明圈的菌株重新接种脱脂奶培养基，置于37℃培养60h。

根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，从中选取蛋白酶活力相对较高的进行摇瓶复筛。

将初筛得到菌株分别接种于l00ml 豆粕培养基中，37℃摇瓶培养60h。

然后取10ml培养液，再次接种到100ml 豆粕培养基中，37℃摇瓶培养60h后，取10ml培养液，离心收集上清液，用Folin 酚法[6]测定上清液中蛋白酶的活力。

根据OD660吸光数值的大小，初步确定这些菌株产生的蛋白酶的活力。

选取产酶活力最高的菌株作酶学性质分析。

1.3.4 酶学性质分析1.3.4.1 菌株的最佳产酶时间将菌株接种于100ml豆粕培养基中，至于37℃摇床培养，每隔12h取出10ml培养液，测定菌体生长量（OD660），离心收集上清液，然后测定上清液中的pH值和蛋白酶的活力[7]。

1.3.4.2 不同反应pH值对蛋白酶活力的影响将菌株接种在100ml豆粕培养基中，置于37℃摇床培养60h后，离心收集上清液，然后测定蛋白酶的活力。

在测定蛋白酶活力时，分别选择不同的酶反应的pH值，然后测定酶活力。

1.3.4.3 蛋白酶的最适反应温度将菌株接种在100ml豆粕培养基中，置于37℃摇床培养60h后，离心收集上清液。

加入反应物后，在不同温度的水浴中反应10min后，再加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸终止反应。

测定酶活。

1.3.5 菌种的纯化配制9ml无菌生理盐水数管，取出一管接复筛菌株一环，混匀后取出1ml加至另外一管中，依次类推进行菌稀释。

用微量移液器分别取各自浓度的菌悬液3μl点到脱脂奶培养基上，60h后观察菌落和水解圈。

1.3.6 菌种的初步鉴定采用细菌形态染色观察及生理生化反应[8]对菌株进行鉴定。

1.3.7 碱性蛋白酶活力测定采用Folin酚法，活力单位（U）以1ml或1g样品在一定条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的1μg 酪氨酸数来表示．将测得的OD值代入酶活力计算公式：X=ΔOD*K*n*(4/10)计算酶活（U/mL）。

其中n为稀释倍数，(4/10)为稀释倍数，K为吸光常数100。

2 结果与分析2.1 菌种的分离与筛选通过常规稀释平板分离方法，初筛得到九株蛋白酶活力较高的菌株，分别编号为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9。

2.2 透明圈试验将九株菌株以无菌牙签点样接种到脱脂奶培养基上，培养18h后观察。

从表1可以看出，B4的比值最大，H/C=7.28，因此用B4作为出发菌株研究酶学性质。

表1 菌落透明圈直径与菌落直径比值表菌株编号B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 H/C 3.7 3.6 2.6 7.2 5.7 3.4 2.3 3.1 4.32.2 初筛菌株蛋白酶活力的OD值660表2 初筛菌株蛋白酶活力的OD660值菌株编号B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9OD6600.164 0.184 0.061 1.365 0.879 0.183 0.040 0.123 0.489 从表2可见4号菌株产酶活力最高。

因此选择该菌株为出发菌株，进一步进行酶学性质研究。

2.3 B4菌株不同培养时间的生长量，酶活力和pH值表3 B4菌株不同培养时间、酶活力和pH值比较培养时间菌体密度OD660酶活OD660酶液pH值12h 重复1 1.012 0.171 6.3 重复2 1.090 0.184 6.5 平均 1.051 0.178 6.424h 重复1 1.860 0.570 7.5 重复2 1.855 0.605 7.5 平均 1.857 0.588 7.536h 重复1 2.403 0.798 8.5 重复2 2.430 0.804 8.3 平均 2.416 0.801 8.448h 重复1 2.498 1.170 8.5 重复2 2.498 1.179 8.5 平均 2.498 1.175 8.560h 重复1 2.500 1.345 8.5 重复2 2.498 1.400 8.5 平均 2.499 1.373 8.572h 重复1 2.501 0.308 9.0 重复2 2.503 0.406 9.0 平均 2.502 0.357 9.0据表3可看出，菌体培养到36h后密度基本稳定，表明此时菌体生长进入稳定期；当培养到60h 时，酶活力达到最高，随后酶活迅速下降。

而pH表现为一直上升最后稳定在8.5-9.0左右。

2.4 不同反应pH值对蛋白酶活力的影响从图1可以看出，pH6.5时酶活力非常低，几乎为零。

随着pH从6.5上升至8.5，酶活力一直2.6菌种的纯化图3是纯化后的平板，上有两个菌落。

2.7菌种的初步鉴定菌落为乳白色，不透明，表面光滑，边缘不整齐；通过显微镜观察，染色后菌株形状为:直杆状，有芽孢和鞭毛，革兰氏阳性。

淀粉水解实验 [8]为阳性，经淀粉酶活力测定具有一定的淀粉酶活性[9]，初步鉴定其为枯草芽孢杆菌。

3 结论本研究从土壤中分离到一株产碱性蛋白酶菌株，最佳产酶时间是在菌体生长的稳定期约60h ；pH8.5时酶活力最高；最适水解反应温度为53℃，50℃-60℃酶活较高并相对稳定。

因此可以认为该菌株所产蛋白酶为嗜热的碱性蛋白酶。

参 考 文 献［1］ Anwar A ，Saleemuddin M ．Alkaline Protease ：A Review l-j]．Bioresource Tech ，1998，64：175—183．［2］ Saeki K ，Hitomi J ，Okuda M ，et a1．A Novel Species of Alkaliphilic Bacillus that Produces an Oxidatively Stable Alkaline Serine Protease[J]．Extremophiles ，2002，6(1)：65—72．［3］ Kumar C G, Takagi H ．Microbial Alkaline Protease ：from a Bioindustrial Viewpoint[ J]．BiotethAdvances ，1999，17：561-594． ［4］ 刘白玲，何先棋，张义正．B. subtilis 蛋白酶高产菌株的筛选与鉴定[J]。

皮革科学与工程，1996，6 (2)：1－8． ［5］ 王海丰．芽孢杆菌蛋白酶产生条件部分酶学性质及其基因的克隆研究。

四川大学硕士学位论文，2002． ［6］ 姚占芳，吴云汉主编．微生物学实验技术[M]。

北京：气象出版社，1998． ［7］ 黄胜．耐高温碱性蛋白酶产生菌GXD9902的筛选及其aprN 基因的克隆。