最新【生物课件】外源基因在大肠杆菌中的表达ppt课件

定性。 具有核糖体结合位点； 具有强启动子；
……
基因工程3大肠杆菌表达、大肠杆菌表达载体的基本成分
RBS
R
P
编码序列
TT
tetr
Ori
TT-G35ACA。。。17。。TA-1T0AAT
ATG（91%） GTG（8%） TTG（1%）
TAAGGAGG（N）8
TAA TGA TAG
此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳 定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。
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（3）翻译起始序列
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核 糖体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效 率的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方 法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。
（3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒；
（4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟， 加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表
达质粒所携带的转化基因；
（5）选择培养基培养，选择转化体。
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2、Hanahan转化法
1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞 的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定 形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜 （DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴 等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。
在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、 Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基，则其稳定 性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6 种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时， 其稳定性则大大提高。

RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
基底水平转录
lacZ lacY lacA
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
高效转录
lacZ lacY lacA
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子。
启动子 P lac P trp P tac
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA
-10 区序列 V5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。
具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP 负调节因子 lac I
Lac 表达系统
正调节因子 CAP
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG

核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响：
大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区 形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位
最新外源基因在大肠杆菌 中的表达.-药学医学精品
资料
7 外源基因在大肠杆菌中的表达
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
7 外源基因在大肠杆菌中的表达
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
培养罐中迅速升温非常困难，因
Ptrp

2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
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原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：
（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制， 可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。
（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于 构建相应的表达载体。
一、启动子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
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1. 原核生物的启动子
原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录 起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。
识别区 Pribnow框 转录起点
16～19bp
5～9bp
5’ TTGACA TATAAT A（G） 3’
RNA … NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH
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N
N
N
N
C
GC
CG C G RNA结构
GC
CG
GC
AU
AU
……NNNN UUUU-OH3
图： 强终止子模式图
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三、SD序列:
mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列 四个特征要素：
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（3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体 保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称 为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱 基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。
（4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与 Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在 长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守 性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重 要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要 因素。