序列分析纯胰蛋白酶

重组L2天冬酰胺酶的鉴定吴　敬　吴梧桐　赖龙生　刘景晶 摘　要　目的:对重组L2天冬酰胺酶进行鉴定。

方法:用基因测序、氨基酸组成分析、N2末端氨基酸测序、胰肽图谱、IEF、分子量、紫外扫描等各种实验手段对重组L2天冬酰胺酶及其天然品进行了全面比较。

结果:重组产品与天然品具有同质性。

结论:重组L2天冬酰胺酶具有较好的应用前景。

关键词　L2天冬酰胺酶,鉴定 中图分类号　R392233Appraisal of R ecombinant L2asparaginaseWu Jing,Wu Wutong,Lai Longsheng,Liu JingjingDepart ment of B iochem ist ry,Chi na Pharm aceutical U niversity(N anji ng210009)Abstract　Purpose:To give an appraisal of recombinant L2asparaginase.Methods:Various analytical techniques including gene sequencing,amino acid composition,analysis of N2terminal amino acid analy2 sis,peptide mapping,IEF,molecular weight and UV2scanning were used.R esults:The recombinant L2 asparaginase had the same quality as that of native products.Conclusion:The application of recombi2 nant L2asparaginase was promising.K ey w ords　L2asparaginase,Appraisal 由于遗传学转录和翻译后水平的变化、生产和纯化过程的改变,工程菌表达的重组产品与天然品比较可能会发生结构、生物学和免疫学的某些变化。

超高效液相色谱－质谱联用法检测不同品种龟甲制龟甲胶的牛皮源成分彭婷婷;江勋【摘要】Objective To investigate the influence of using different kinds of tortoise shell on the content of bovine-hide gelatin from glue of tortoise shell. Methods The UPLC-MS method was performed on the Zorbax C18 column (50 mm × 2. 1 mm,1. 8 μm),by a gradient elution using 0. 1% formic acid aqueous solution-0. 1% formic acid in acetonitrile as the mobile phase at a flow rate of 0. 3 mL/min and at 40 ℃. Glue of tortoise shell were detected which were made from different kinds of tortoise shell. Results It was founded that the test results were positive which contained Trachemys scripta eleganns shell,while negative results were detected which were made by pure Chinemys reevesiis shell. Conclusion The method is simple,accucate,specific and high sensitivity which provided a basis for quality′s effective control of glue of tortoise shell.%目的：考察不同品种的龟甲原料对龟甲胶中牛皮源成分含量的影响。

注射用重组人促红素EPO（CHO细胞）3检定3.1原液检定3.1.1蛋白质含量用4g/L碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml，作为供试品溶液。

以4g/L 碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在320nm，325nm，330nm，335nm ,340nm，345nm和350nm的吸光度。

用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做直线回归，求得回归方程。

照紫外-可见分光光度法（附录II A），在波长276nm～280nm处，测定供试品溶液最大吸光度Amax，将Amax对应波长带入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散射。

按下式计算，应不低于0.5 mg/ml。

蛋白质含量（mg/ml）=（Amax-A光散射）÷7.43×供试品稀释倍数×103.1.2生物学活性3.1.2.1体内法依法测定（附录Ⅹ B）。

3.1.2.2体外法按酶联免疫法试剂盒说明书测定。

3.1.3体内比活性每1mg蛋白质应不低于1.0×105IU。

3.1.4纯度3.1.4.1电泳法依法测定（附录ⅣC）。

用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。

3.1.4.2高效液相色谱法依法测定（附录ⅢB）。

亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm,粒度10μm，直径7.5mm,长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量20～100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。

按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。

3.1.5分子量依法测定（附录ⅣC）。

用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36～45kD。

第1篇一、实验目的本实验旨在通过液相质谱法（LC-MS/MS）检测胶原蛋白多肽，验证该方法在胶原蛋白检测中的灵敏度和特异性，为胶原蛋白的定量分析提供实验依据。

二、实验原理液相质谱法是一种高效、灵敏的分析技术，结合了液相色谱（LC）和质谱（MS）的优点。

本实验采用液相色谱-质谱联用技术，通过检测胶原蛋白特异的多肽片段，实现对胶原蛋白的定性和定量分析。

三、实验材料1. 仪器：液相色谱-质谱联用仪、高效液相色谱仪、分析天平、水浴锅、涡旋仪等。

2. 试剂：胶原蛋白试样、胰蛋白酶、甲醇、磷酸、流动相储备液、标准品、内标品等。

3. 试剂规格：胰蛋白酶（1mg/mL）、甲醇（分析纯）、磷酸（分析纯）、流动相储备液（甲醇：水=65：35）。

四、实验步骤1. 样品制备（1）将胶原蛋白试样溶解于适量去离子水中，加入适量胰蛋白酶，在37℃水浴中酶解过夜。

（2）酶解结束后，将样品用滤膜过滤，取滤液进行液相色谱分析。

2. 液相色谱-质谱条件（1）色谱柱：Eclipse XDB C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）。

（2）流动相：甲醇-水（65：35）。

（3）流速：0.8mL/min。

（4）柱温：30℃。

（5）进样量：10μL。

3. 质谱条件（1）电离方式：电喷雾电离（ESI）。

（2）扫描方式：多反应监测（MRM）。

（3）碰撞能量：20eV。

4. 数据分析（1）根据质谱图谱，使用肽段序列信息和数据库匹配算法鉴定胶原蛋白。

（2）通过计算肽段的峰面积或峰高，定量样品中的胶原蛋白。

五、实验结果1. 胶原蛋白多肽的鉴定根据质谱图谱，成功鉴定出胶原蛋白特异的多肽片段，如Gly-Pro-Gly-Gly等。

2. 胶原蛋白的定量分析通过液相色谱-质谱联用技术，对样品中的胶原蛋白进行定量分析，结果显示胶原蛋白含量为0.5mg/mL。

六、实验讨论1. 液相质谱法在胶原蛋白检测中的应用具有高灵敏度和高特异性，可以准确检测出不同来源的胶原蛋白。

阿胶中牛皮源质量的补充检验方法阿胶中牛皮源质量的补充检验方法[检查]牛皮源成分照高效液相色谱-质谱法（中国药典2010年版一部附录VI D和二部附录IX J）测定。

色谱、质谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅键合硅胶（2.1mm×100 mm，1.8μm）为填充剂；以0.1%甲酸溶液为流动组A，以乙腈为流动组B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为0.3ml/mln；采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（EST），进行多反应监测，选择m/z641.3(双电荷)——726.2，783.3作为检测离子对，对照品溶液（进样量为5μm）中牛皮特征肽A的色谱峰（m/z641.3－726.2）信噪比应大于10：1。

时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）0~25 95—80 5—2025~40 80—50 20—50对照品溶液的制备取牛皮特征肽A适量，精密称定，如阿胶基质溶液（取阿胶对照药材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%NH4HCO3溶液40ml，超声处理30分钟，使样品完全溶解，加1% NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

）的，制成每1ml含0.3μm牛皮特征肽A的对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末0.1g，置50 ml量瓶中，加1% NH4HCO3溶液40ml，超声处理30分钟，使样品完全溶解，加1% NH4HCO3溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

酶解取上述结照品溶液和供试品溶解各5 ml，过0.22μm的滤膜，精密量取100μl滤液到200μl微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液（取序列分析纯胰蛋白酶适量，加1% NH4HCO3溶液溶解，制成每1μl中含1μl胰蛋白酶的溶液）10μl，摇匀，37℃恒温酶解12h，即得。

测定法分别精密吸取酶解后的对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱－质谱联用仪，测定，即得。

结果判断供试品的m/z641.3—m/z726.2和m/z641.3—m/z783.3提取离子流图色谱中，应不得同时出现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰；若同时出现，则要求样品中m/z641.3—m/z726.2提取离子流图中色谱峰面积不得超过对照品m/z641.3—m/z726.2提取离子流图的峰面积。

胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。

测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。

下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。

实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。

2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。

3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。

4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。

5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。

6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。

实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。

用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。

2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。

黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。

通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。

数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。

2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。

注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。

2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。

3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。

胰蛋白酶药典标准胰蛋白酶是一种消化酶，被广泛应用于临床医学中治疗消化系统疾病，如胰腺炎、胰腺癌、胃肠手术后等。

药典标准是评定药品质量的重要参考，下面将详细介绍胰蛋白酶的药典标准。

胰蛋白酶的药典标准主要包括国际药典（比如美国药典、欧洲药典）和中国药典两个方面。

这些药典标准规定了胰蛋白酶的质量要求、生产工艺以及检测方法等方面。

以下是对其中几个重要药典标准的介绍：1.国际药典：美国药典和欧洲药典规定了胰蛋白酶的质量要求。

例如，美国药典规定了胰蛋白酶的单位活性应满足特定标准，比如1 USP单位相当于3.6微克胰蛋白酶，并规定了对其它微生物污染的限制。

2.中国药典：中国药典对胰蛋白酶的质量要求与国际药典接近，但有些细节的要求有所不同。

例如，中国药典规定了胰蛋白酶的酶活力不得低于10,000 USP单位/g，并规定了胰蛋白酶的酶活性测定方法。

药典标准还要求生产工艺和质量控制方面的要求。

生产工艺包括胰蛋白酶的提取、纯化、浓缩和干燥等，要求按照良好的制造规范进行操作。

质量控制方面要求对原辅材料进行严格检测，确保其质量符合标准，并要求对成品进行全面检测，确保其有效成分含量符合规定。

胰蛋白酶的标准化是确保其质量和疗效的关键。

通过遵循药典标准，可以保证不同厂家生产的胰蛋白酶具有相同的活性，并且可以使医生和患者更容易比较不同品牌或批次的胰蛋白酶的治疗效果。

总结起来，胰蛋白酶作为一种重要的消化酶，其药典标准规定了胰蛋白酶的质量要求、生产工艺和检测方法等方面。

通过遵循这些标准，可以确保胰蛋白酶在临床应用中的质量和疗效，促进患者的康复。

医生和患者可以放心使用符合药典标准的胰蛋白酶，获得更好的治疗效果。

实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。

实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。

胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。

酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。

胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。

这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。

不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。

E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。

由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。

在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。

器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。

试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。

1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。

2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。

Cat.No.：SRT0202CAS:9002-07-7EC:3.4.21.4储存温度：-70℃别名：重组修饰胰蛋白酶；重组甲基化修饰胰蛋白酶；重组甲基化修饰突变胰蛋白酶来源：重组胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达蛋白序列：氨基酸序列与猪胰腺来源的阳离子型胰蛋白酶完全一致。

1.产品简介雅心重组胰蛋白酶是由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的阳离子型胰蛋白酶完全一致，无糜蛋白酶等杂酶污染，不含有且不需要TPCK抑制其他酶活性，活性高，酶切特异性高。

胰蛋白酶容易自切产生自身自切片段影响质谱分析结果，甲基化修饰和突变保证其不自切，从而也去除了因自切而产生的假糜蛋白酶的活性。

2.产品特性来源重组大肠杆菌外观澄清，无色液体比活（单位/mg蛋白）≥4500USP units/mg pro.蛋白浓度0.5mg/ml溶于50mM HAC蛋白电泳单一主条带电泳（分子量）24.0±2.4kDa纯度（HPLC）≥95%3.推荐使用方法建议使用50mMHAc或1mM HCl溶解或稀释。

使用时，稀释在50mM NH4HCO3或者ph7.0-8.0的缓冲溶液中。

在酶切缓冲液中建议使用1mM CaCl2，重组胰蛋白酶：目的蛋白=1：20-1：100，最适PH为7.0-8.0。

4.储存和运输稳定性储存稳定性：液体储存于-70℃，24个月稳定；在4℃或者25℃条件下24小时内可保持90%以上的活性；反复冻融5次，无活性损失；在含有50mM NH4HCO3稀释液0.05mg/ml溶液浓度中，37℃条件下孵育3小时，95％以上的活性被保持，对于长期如20小时孵育，建议加入1mM CaCl2。

运输稳定性：蓝冰保温运输，活性稳定。

5.产品优势●序列分析纯蛋白酶：特异性高，稳定性好。

●无动物源性：重组生产，无外源性的病毒污染，生产过程不使用任何动物源原料。

●质量稳定：批量生产，可保证稳定连续的批次生产；产品批次间无差异，质量稳定。

实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。

实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。

胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。

酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。

胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。

这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。

不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。

E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。

由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。

在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。

器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。

试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。

1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。

2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。