胰蛋白酶活力测定

猪胰蛋白酶酶活力的测定实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。

Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。

重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。

最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。

此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。

胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。

因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。

目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。

用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。

本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。

酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。

胰蛋白酶活力测定一、实验原理1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。

2、蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。

二、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅三、实验试剂1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。

在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。

6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)四、实验步骤1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。

以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。

样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数五、实验结果由上可知，样品的吸光度y=0.993，则x=0.8μg，即A=0.8μg 故根据公式样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数胰蛋白酶活力为：0.8 /15 ╳13=0.69六、实验分析1. 测定胰蛋白酶活力的原理?答：蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。

按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。

匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。

酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。

1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。

1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。

中国海洋大学实验报告姓名庞裕智专业年级生命基地班2011 题目胰蛋白酶活力的测定学号040312011025 科目生物化学实验时间周一90节同组者田特一、实验目的学习和掌握胰蛋白酶活力测定的方法。

二、实验原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。

蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。

三、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅四、实验试剂、1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。

在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。

6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)五、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。

以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。

样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂六、实验结果酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。

样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由标准曲线知，当OD680=0.244时，样品中酪氨酸的微克数为A=181ug ∴样品中胰蛋白酶活力单位为181/15×13=156.87七、实验分析1.注意事项（1）胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；（2）要在酶的最适温度40℃下反应；（3）要在酶的最适PH为7.5调节下反应；（4）催化反应的时间控制精确；（5）向样品测定的1号试管加入三氯醋酸时要快；（6）加入各种药品的量要精确，特别是酶。

胰蛋白酶抑制因子的测定方法：称取1g 样品( 液体也以质量称取), 每1g 样品用50ml 0.01 mol/L 的氢氧化钠溶液提取3h( 搅拌),样品的最大用量约为1g 。

分别吸取0 、0 . 6 、1 . 0 、1 . 4 、1 . 8 、2 . 0ml 的上层提取液注入2 组试管中, 并加水稀释至2ml. 分别加入2ml 胰蛋白酶溶液于每支试管中, 混匀。

在加入5ml 预热至37 ℃的BAPNA溶液,并严格地于10min 后加入1ml 醋酸溶液并混匀,已停止反应。

将内容物过滤, 并于410nm 出测定光密度值。

对于空白对照管, 是取2ml 样本提取液加5ml BAPNA试剂并保温在37 ℃10min , 然后加入1ml 醋酸溶液及2ml 胰蛋白酶溶液.活力的表示方法：一个胰蛋白酶单位(AU), 是10ml 反映溶液在本文叙述的条件下,于410nm 处测得反映前后所增加0.01光密度为1 单位( Absorbance Unit),胰蛋白酶抑制剂活力用胰蛋白酶抑制剂单位( TLU) 表示。

结果计算：用TLU ml 对分析所用提取液体积( ml)做标准曲线,并外推到零。

每克样品的TLU 值=延伸值×稀释倍数, 当用分析的提取液的TLU ml 对分析液体积做图并不是直线关系时，则计算出每单位体积提取液中TLU 平均值, 则TLU g 样品=平均值×稀释倍数。

试剂：0 . 05mol/ L tris - CaCl2 溶液( 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液) pH: 8 . 2 溶解6 . 05g 三羟甲基氨基甲烷及2 . 94gCaCl2 . H2O 于约900ml 蒸馏水中, 调节至pH 为8 . 2 ,并用蒸馏水稀释成1L.底物溶液：称取40mg BAPNA溶于1ml 二甲基亚砜中,并用已预热到37 ℃的tris-CaCl2 溶液稀释成100ml 。

胰蛋白酶溶液:称取4mg 胰蛋白酶(不含盐) 溶于200ml 0.001mol/L的HCl 中。

胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。

测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。

下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。

实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。

2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。

3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。

4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。

5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。

6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。

实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。

用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。

2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。

黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。

通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。

数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。

2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。

注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。

2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。

3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。

胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。

在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。

胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。

pH＜3时，胰蛋白酶易变性。

PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。

胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。

重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。

胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。

[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。

此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。

因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。

本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。

在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。

胰蛋白酶药典标准
胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的消化酶，可用于提高肠道消化功能，改善胃肠道疾病。

胰蛋白酶的药典标准是按照国家药典制定的，以下是胰蛋白酶药典标准的相关参考内容：
【名称】胰蛋白酶
【药典标准】
1. 性状：胰蛋白酶为白色或几乎白色的粉末，无臭。

2. 酶活力测定：胰蛋白酶的酶活力以消化明胶法测定。

3. 蛋白含量测定：胰蛋白酶的蛋白含量以紫外吸收光度法测定。

4. 储存条件：胰蛋白酶应密封保存于阴凉干燥处，避免阳光直射。

【净含量】胰蛋白酶的净含量应符合生产商标注，一般以毫克或克为单位。

【适应症】胰蛋白酶广泛用于胃肠道消化功能减退，如慢性胰腺炎、胰腺切除术后，以及胃肠道手术后等。

【用法用量】成人常规剂量为每次口服胰蛋白酶20000-30000
单位，饭前或饭时服用。

具体剂量应根据患者消化功能及病情而定。

【不良反应】胰蛋白酶在正常剂量下一般不会引起不良反应，少数患者可能出现过敏反应如发热、皮疹、荨麻疹等，此时应停药并及时就医。

【注意事项】
1. 对胰蛋白酶过敏者禁用。

2. 胰蛋白酶可能与一些抗酸药物相互作用，如需要联用应在医生指导下进行。

3. 儿童、孕妇、哺乳期妇女及老年患者应在医生指导下使用。

【贮存期限】胰蛋白酶的贮存期限以生产商标注为准，一般为2-3年。

【生产企业】胰蛋白酶的生产企业应符合相关法规要求，具有药品生产许可证。

以上是胰蛋白酶药典标准的一些相关参考内容。

胰蛋白酶在临床上被广泛应用于改善消化功能减退的患者，但使用时应遵循医生的指导，且注意可能的不良反应和禁忌症等。