荧光定量PCR实验及数据分析
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常用荧光定量标记方法
• 非特异性荧光标记 • SYBR Green I
• 特异性荧光标记 • TaqMan Probe
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SYBR Green I 染料法－－原理
• SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
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荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认
• 线性关系、扩增效率确认
– 相关系数（R2）：大于0.98 – 标准曲线斜率：-3 － -3.5 – PCR扩增效率（E）：0.9-1.2
• 检测灵敏度确认
– 35Cycles内可得到好的定量结果 – 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增
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绝对定量质粒标准品的制备
目的基因
基因组DNA PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因 目的基因
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用
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质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
• 倍比梯度稀释方法：
– 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii – 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii – 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv – 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
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Taqman 探针法－－工作机理
探针
热变性
引物
报告基团
R
淬灭基团
引物和探针与模板退火
DNA聚合酶
R
探针
延伸反应
R
R
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Taqman 探针法－－PCR体系的建立
1. 引物、探针的设计：
– 探针Tm为68-70℃, <30 bp, 5’不能有G, G可能会淬灭荧光素 – 引物尽量靠近探针, 扩增片段<400 bp, 引物Tm为59-60℃
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内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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荧光定量PCR的解析方法
绝对定量解析方法
相对定量解析方法
荧光定量PCR实验原理及数据分析
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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荧光定量PCR原理－－定义
融解曲线分析，出现 杂峰其他产物出现非 特异性荧光： 定量不准确
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SYBR Green I 染料法－－优缺点 优 点
使用方便，不必设计 复杂探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析 与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起 始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
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荧光定量PCR原理－－常用名词概念
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绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的 标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
2 5
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绝对定量分析几要素
• • 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、 PCR产物、基因组DNA等。 • 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统 计显著性。 • • 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。 实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。
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荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性
纵轴：荧光信号Байду номын сангаас 横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点： • 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； • Ct值极具重现性
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
n
理想的PCR反应
n：扩增循环数
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几种荧光定量PCR方法的应用比较
方法 SYBR Green I 优点 适用性广 灵敏 方便 便宜 特异性高 重复性好 缺点 引物要求高 易出现非特异性带 适用范围 适合科研中对各种目的基因定量 分析，基因表达量的研究，转基 因重组动植物的研究
TaqMan
价格高 只适合特定目标
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33
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R = 0.9978
扩增效率（E）计算 E =10-1/斜率 -1 =10-1/-3.29 -1 =2.01-1 =1.01
2
25 Ct 20 15 5×103 5×104 Copies 5×105 5×106
• No template control确认
– 35 Cycles内无引物二聚体产生
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内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
•
拷贝数的计算：
– 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 – 样本分子量=碱基数×324 – 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
• • 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性 空白对照 • 实验步骤：提取HBV DNA；
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SYBR Green I 染料法－－作用机理
热变性
引物退火
延伸反应
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SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点
• 问题点：
– SYBR Green I 与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。
Ct1
28.18 25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2
28.64 25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct
28.41 25.19 22.28 18.77 20.5
STD
0.16 0.04 0.12 0.10 0.05
Xn＝X0 * 2
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
非理想的PCR反应 Xn＝X0 *（1＋En）n
n：扩增循环数
En：扩增效率
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
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Taqman 探针法－－优缺点 优 点
高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
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实时荧光定量PCR分类－－分子信标
环
标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补
设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
Sample
标准品 标准品 标准品 标准品 未知样品 空白对照
copies/ml
5×103 5×104 5×105 5×106 ?
2. 反应参数的确定：
– 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S （Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
3. 优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
– 引物浓度：100-900nM – 探针浓度：50-300nM
4. 其他与常规PCR相同
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
在扩增产物达到荧光阈值时 XCt＝X0 * （1＋En）Ct＝M （1）
XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后， 它是一个常数，定为M
方程式（1）两边同取对数得： Log2M＝Log2X0 *（1＋En）Ct 整理方程式（2）： Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1＋En）
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
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荧光定量PCR原理－－扩增曲线
平台期
荧光基团
Rn（荧光强度）
Lg－liner phase
Baseline
荧光检测元件
Cycle（循环数）
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荧光定量PCR原理－－荧光阈值
平台期
前15个循环信号作为荧光本底 信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～15个 循环的荧光信号的标准偏差的 10倍 手动设置:大于荧光背景值和阴 性对照的荧光最高值；进入指 数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值
